Die Amerikaanse Nobelpryswenner in chemie Kary Mullis is in die ouderdom van 74 in Kalifornië oorlede. Volgens sy vrou het die dood op 7 Augustus plaasgevind. Die rede is hart- en asemhalingsversaking as gevolg van longontsteking.
Oor watter bydrae hy tot biochemie gemaak het en waarvoor hy die Nobelprys ontvang het, sal ons vertel word deur James Watson self, die ontdekker van die DNS-molekule.
'n Uittreksel uit 'n boek deur James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Geskiedenis van die genetiese revolusie
Hoofstuk 7. Die menslike genoom. lewensskrif
...
Die polimerase kettingreaksie (PCR) is in 1983 uitgevind deur biochemikus Cary Mullis, wat vir Cetus gewerk het. Die ontdekking van hierdie reaksie was nogal merkwaardig. Mullis het later onthou: “Een Vrydagaand in April 1983 het ek 'n ligflits gehad. Ek het met ’n maanverligte kronkelende bergpad gery tot in Noord-Kalifornië, die rand van die rooibos.” Dit is indrukwekkend dat dit in hierdie situasie was dat hy deur inspirasie besoek is. En dit is glad nie dat Noord-Kalifornië spesiale paaie het wat bydra tot insig nie; dis net dat 'n vriend van hom eenkeer gesien het hoe Mullis roekeloos op 'n ysige tweerigtingpad afstorm en dit het hom glad nie gepla nie. ’n Vriend het aan die New York Times gesê: “Mullis het hom verbeel hy gaan sterf toe hy in ’n rooibosboom vasgery het. Daarom is hy vir niks bang terwyl hy bestuur, as daar nie rooibosse langs die pad is nie. Die teenwoordigheid van rooibosse langs die pad het Mullis gedwing om te fokus en ... hier is dit, insig. Vir sy uitvinding in 1993 het Mullis die Nobelprys in Chemie ontvang en het sedertdien selfs meer vreemd in sy optrede geword. Hy is byvoorbeeld 'n voorstander van die revisionistiese teorie dat VIGS nie met MIV verband hou nie, wat sy eie reputasie aansienlik ondermyn het en met dokters ingemeng het.
PCR is 'n redelik eenvoudige reaksie. Om dit uit te voer, benodig ons twee chemies gesintetiseerde primers wat komplementêr is tot teenoorgestelde ente van verskillende stringe van die vereiste DNS-fragment. Primers is kort stukke enkelstring-DNS, elk ongeveer 20 basispare lank. Die eienaardigheid van die primers is dat hulle ooreenstem met die dele van DNS wat geamplifiseer moet word, dit wil sê die DNS-sjabloon.
(Beeld klikbaar) Carey Mullis, uitvinder van PCR
Die spesifisiteit van PCR is gebaseer op die vorming van komplementêre komplekse tussen die templaat en primers, kort sintetiese oligonukleotiede. Elkeen van die primers is komplementêr tot een van die kettings van die dubbelstrengs templaat en beperk die begin en einde van die geamplifiseerde streek. Trouens, die verkrygde "matriks" is 'n hele genoom, en ons doel is om fragmente van belang daaruit te isoleer. Om dit te doen, word die dubbelstring-DNS-sjabloon vir etlike minute tot 95 °C verhit om die DNA-stringe te skei. Hierdie stap word denaturasie genoem omdat die waterstofbindings tussen die twee DNA-stringe gebreek word. Wanneer die stringe geskei word, word die temperatuur verlaag om die primers toe te laat om aan die enkelstrengs sjabloon te bind. DNA-polimerase begin DNA-replikasie deur aan 'n segment van 'n ketting van nukleotiede te bind. Die DNA-polimerase-ensiem repliseer die sjabloonstring deur 'n primer as 'n primer of kopie-sjabloon te gebruik. As gevolg van die eerste siklus verkry ons veelvuldige opeenvolgende verdubbeling van 'n sekere gedeelte van DNS. Vervolgens herhaal ons hierdie prosedure. Na elke siklus kry ons 'n teikenterrein in dubbele hoeveelheid. Na vyf-en-twintig PCR-siklusse (dit wil sê in minder as twee uur), het ons die DNS-afdeling van belang vir ons in 'n hoeveelheid 225 keer groter as die oorspronklike (dit wil sê, ons het dit ongeveer 34 miljoen keer versterk). Trouens, by die insette het ons 'n mengsel van primers, sjabloon-DNA, DNA-polimerase-ensiem en vrye basisse A, C, G en T gekry, die hoeveelheid van 'n spesifieke reaksieproduk (beperk deur primers) groei eksponensieel, en die aantal " lang” DNA-kopieë is lineêr, dus in reaksie produkte oorheers.
Amplifikasie van die verlangde DNA-gebied: polimerase kettingreaksie
In die vroeë dae van PCR was die hoofprobleem dat na elke verhitting-verkoelingsiklus, DNA-polimerase by die reaksiemengsel gevoeg moes word, aangesien dit by 95 °C geïnaktiveer is. Daarom was dit nodig om dit weer voor elkeen van die 25 siklusse by te voeg. Die reaksieprosedure was relatief ondoeltreffend, het baie tyd en die polimerase-ensiem vereis, en die materiaal is baie duur. Gelukkig het Moeder Natuur tot die redding gekom. Baie diere voel gemaklik by temperature ver bo 37°C. Hoekom is 37°C so belangrik vir ons? Dit is omdat hierdie temperatuur optimaal is vir E. coli, waaruit die polimerase-ensiem vir PCR oorspronklik verkry is. In die natuur is daar mikroörganismes wie se proteïene, oor miljoene jare se natuurlike seleksie, meer bestand geword het teen hoë temperature. Daar is voorgestel om DNA-polimerases van termofiele bakterieë te gebruik. Hierdie ensieme was termostabiel en kon baie reaksiesiklusse weerstaan. Die gebruik daarvan het dit moontlik gemaak om PCR te vereenvoudig en te outomatiseer. Een van die eerste termostabiele DNS-polimerases is geïsoleer uit die bakterie Thermus aquaticus, wat in die warmwaterbronne van Yellowstone Nasionale Park woon, en is Taq-polimerase genoem.
PCR het vinnig die belangrikste werkesel van die Menslike Genoomprojek geword. Oor die algemeen verskil die proses nie van dié wat deur Mullis ontwikkel is nie, dit was net geoutomatiseer. Ons was nie meer afhanklik van 'n skare blindoë gegradueerde studente wat met moeite druppels vloeistof in plastiekproefbuise gooi nie. In moderne laboratoriums wat molekulêre genetiese navorsing doen, word hierdie werk op robotvervoerbande uitgevoer. Die PCR-robotte wat betrokke is by 'n volgordebepalingsprojek so massief soos die menslike genoom werk meedoënloos met groot volumes hittebestande polimerase. Sommige wetenskaplikes wat in die Menslike Genoomprojek werk, was woedend oor die onredelik hoë fooie wat die eienaar van die PCR-patent, die Europese industriële en farmaseutiese reus Hoffmann-LaRoche, by die koste van verbruiksgoedere bydra.
Nog 'n "rybegin" was die DNA-volgordebepalingsmetode self. Die chemie agter hierdie metode was destyds nie meer 'n nuwigheid nie: Die Menslike Genoomprojek (HGP) het dieselfde vernuftige metode aangeneem wat Fred Senger in die middel-1970's ontwikkel het. Die innovasie was in die skaal en mate van outomatisering wat volgordebepaling kon bereik.
Outomatiese volgordebepaling is oorspronklik in Lee Hood se laboratorium by Caltech ontwikkel. Hy het aan die hoërskool in Montana gegradueer en Amerikaanse voetbal as voorspeler gespeel; danksy Hood het die span die staatskampioenskap meer as een keer gewen. Spaninteraksievaardighede was vir hom nuttig in sy wetenskaplike loopbaan. Hood se laboratorium het 'n bont span van chemici, bioloë en ingenieurs gehuisves, en sy laboratorium het gou 'n leier in tegnologiese innovasie geword.
Trouens, die outomatiese volgordebepalingmetode is deur Lloyd Smith en Mike Hunkapiller uitgevind. Mike Hunkapiller, wat toe in Hood se laboratorium gewerk het, het Lloyd Smith genader met 'n verbeterde volgordebepalingsmetode wat elke tipe basis 'n ander kleur sou vlek. So 'n idee kan die doeltreffendheid van die Sanger-proses verviervoudig. Sanger se volgordebepaling in elk van die vier proefbuise (volgens die aantal basisse) met die deelname van DNA-polimerase produseer 'n unieke stel oligonukleotiede van verskillende lengtes, insluitend die primervolgorde. Vervolgens is formamied by die buise gevoeg om die kettings te skei, en elektroforese is in 'n poliakrielamiedgel in vier bane uitgevoer. In die Smith- en Hunkapiller-variant word dideoksinukleotiede met vier verskillende kleurstowwe gemerk en PCR word in een buis uitgevoer. Dan, tydens poliakrielamiedgelelektroforese, prikkel 'n laserstraal op 'n spesifieke plek in die jel die aktiwiteit van die kleurstowwe op, en die detektor bepaal watter nukleotied tans deur die gel migreer. Smith was eers pessimisties – hy was bang dat die gebruik van ultra-lae dosisse van die kleurstof daartoe sou lei dat die nukleotiedstreke nie onderskeibaar sou wees nie. Met 'n uitstekende begrip van lasertegnologie het hy egter gou 'n uitweg gevind deur spesiale fluorochroomkleurstowwe wat fluoresseer wanneer dit aan laserstraling blootgestel word.
(Volledige weergawe - 4,08 MB) Kleindruk: DNS-volgorde gedekodeer met 'n outomatiese volgordebepaling, verkry vanaf 'n outomatiese volgordebepalingsmasjien. Elke kleur stem ooreen met een van die vier basisse
In die klassieke weergawe van die Sanger-metode dien een van die stringe van die geanaliseerde DNS as 'n sjabloon vir die sintese van 'n komplementêre string deur die DNS-polimerase-ensiem, dan word die volgorde van DNS-fragmente volgens grootte in die jel gesorteer. Elke fragment, wat tydens sintese in die DNA ingesluit is en daaropvolgende visualisering van die reaksieprodukte moontlik maak, word gemerk met 'n fluoresserende kleurstof wat ooreenstem met die terminale basis (dit is bespreek op p. 124); daarom sal die fluoressensie van hierdie fragment 'n identifiseerder vir hierdie basis wees. Dan bly dit net om die opsporing en visualisering van die reaksieprodukte uit te voer. Die resultate word deur 'n rekenaar ontleed en aangebied as 'n reeks gekleurde pieke wat ooreenstem met vier nukleotiede. Die inligting word dan direk na die rekenaar se inligtingstelsel oorgedra, wat die tydrowende en soms pynlike data-invoerproses uitskakel wat volgordebepaling baie moeilik gemaak het.
» Vir meer inligting oor die boek, besoek asseblief
»
»
Vir Khabrozhiteli 25% afslag op die koepon - PCR
Bron: will.com