توفيت الأمريكية الحائزة على جائزة نوبل في الكيمياء ، كاري موليس ، في كاليفورنيا عن عمر يناهز 74 عامًا. وفقا لزوجته ، حدثت الوفاة في 7 أغسطس. والسبب هو فشل القلب والجهاز التنفسي بسبب الالتهاب الرئوي.
حول المساهمة التي قدمها في الكيمياء الحيوية والتي حصل من أجلها على جائزة نوبل ، سوف يخبرنا جيمس واتسون نفسه ، مكتشف جزيء الحمض النووي.
مقتطف من كتاب لجيمس واتسون وأندرو بيري وكيفن ديفيس
الحمض النووي. تاريخ الثورة الجينية
الفصل 7. الجينوم البشري. نص الحياة
...
تم اختراع تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في عام 1983 من قبل عالم الكيمياء الحيوية كاري موليس ، الذي عمل في شركة Cetus. كان اكتشاف رد الفعل هذا رائعًا للغاية. يتذكر موليس لاحقًا: "ذات ليلة جمعة في أبريل 1983 ، كان لدي وميض من الضوء. كنت أقود سيارتي على طريق جبلي متعرج مضاء بنور القمر إلى شمال كاليفورنيا ، على حافة الخشب الأحمر ". من المثير للإعجاب أنه في هذه الحالة تمت زيارته بالإلهام. ولا يتعلق الأمر على الإطلاق بوجود طرق خاصة في شمال كاليفورنيا تساهم في تكوين البصيرة ؛ إنه مجرد صديق له رأى موليس يندفع بتهور في طريق جليدي باتجاهين ولم يزعجه على الإطلاق. قال صديق لصحيفة نيويورك تايمز: "تخيل موليس أنه سيموت عندما اصطدم بشجرة خشب أحمر. لذلك ، فهو لا يخاف من أي شيء أثناء القيادة ، إذا لم يكن هناك خشب أحمر على طول الطريق. أجبر وجود الأخشاب الحمراء على طول الطريق موليس على التركيز و ... ها هي البصيرة. لاختراعه في عام 1993 ، حصل موليس على جائزة نوبل في الكيمياء ومنذ ذلك الحين أصبح أكثر غرابة في أفعاله. على سبيل المثال ، هو مؤيد للنظرية التنقيحية القائلة بأن الإيدز لا علاقة له بفيروس نقص المناعة البشرية ، مما قوض سمعته بشكل كبير وتداخل مع الأطباء.
تفاعل البوليميراز المتسلسل هو رد فعل بسيط إلى حد ما. لتنفيذه ، نحتاج إلى اثنين من البادئات المركبة كيميائيًا والتي تكمل الأطراف المتقابلة من خيوط مختلفة من جزء الحمض النووي المطلوب. الاشعال عبارة عن امتدادات قصيرة من الحمض النووي أحادي السلسلة ، يبلغ طول كل منها حوالي 20 زوجًا قاعديًا. خصوصية البادئات هي أنها تتوافق مع أقسام الحمض النووي التي تحتاج إلى تضخيم ، أي قالب الحمض النووي.
(الصورة قابلة للنقر) كاري موليس ، مخترع PCR
تعتمد خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل على تكوين مجمعات تكميلية بين القالب والبادئات ، قليل النوكليوتيدات الاصطناعية القصيرة. كل من البادئات مكمل لإحدى سلاسل القالب المزدوج الشريطة ويحد من بداية ونهاية المنطقة المضخمة. في الواقع ، فإن "المصفوفة" التي تم الحصول عليها هي جينوم كامل ، وهدفنا هو عزل أجزاء من الاهتمام عنها. للقيام بذلك ، يتم تسخين قالب DNA مزدوج الشريطة إلى 95 درجة مئوية لعدة دقائق لفصل خيوط الحمض النووي. هذه الخطوة تسمى تمسخ لأن الروابط الهيدروجينية بين شريطين من الحمض النووي مكسورة. عندما يتم فصل الخيوط ، يتم خفض درجة الحرارة للسماح للطلاء التمهيدي بالارتباط بالقالب المفرد الذي تقطعت بهم السبل. يبدأ بوليميراز الحمض النووي في تكرار الحمض النووي عن طريق الارتباط بجزء من سلسلة من النيوكليوتيدات. يقوم إنزيم بوليميريز الحمض النووي بتكرار خيط القالب باستخدام مادة أولية كطبقة أولية أو قالب نسخ. نتيجة للدورة الأولى ، نحصل على مضاعفة متتابعة متعددة لجزء معين من الحمض النووي. بعد ذلك ، نكرر هذا الإجراء. بعد كل دورة ، نحصل على موقع مستهدف بكمية مضاعفة. بعد 225 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (أي في أقل من ساعتين) ، أصبح لدينا قسم الحمض النووي الذي يهمنا بمقدار 34 مرة أكبر من الأصل (أي أننا قمنا بتضخيمه حوالي XNUMX مليون مرة). في الواقع ، عند الإدخال ، حصلنا على مزيج من البادئات ، والحمض النووي النموذجي ، وإنزيم بوليميريز الحمض النووي والقواعد الحرة A ، و C ، و G ، و T ، وتزداد كمية منتج تفاعل معين (محدود بواسطة البادئات) بشكل كبير ، وعدد " إن نسخ الحمض النووي الطويلة "خطية ، وبالتالي ، في منتجات التفاعل هي السائدة.
تضخيم منطقة DNA المرغوبة: تفاعل البلمرة المتسلسل
في الأيام الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كانت المشكلة الرئيسية هي أنه بعد كل دورة تبريد وتسخين ، يجب إضافة بوليميريز الحمض النووي إلى خليط التفاعل ، حيث تم تعطيله عند 95 درجة مئوية. لذلك ، كان من الضروري إعادة إضافته قبل كل دورة من 25 دورة. كان إجراء التفاعل غير فعال نسبيًا ، وتطلب الكثير من الوقت وإنزيم البوليميراز ، والمادة غالية جدًا. لحسن الحظ ، جاءت الطبيعة الأم للإنقاذ. تشعر العديد من الحيوانات بالراحة في درجات حرارة أعلى بكثير من 37 درجة مئوية. لماذا 37 درجة مئوية مهمة جدا بالنسبة لنا؟ هذا لأن درجة الحرارة هذه هي الأمثل للإشريكية القولونية ، والتي تم الحصول منها على إنزيم البوليميراز لـ PCR. في الطبيعة ، هناك كائنات دقيقة أصبحت بروتيناتها ، على مدى ملايين السنين من الانتقاء الطبيعي ، أكثر مقاومة لدرجات الحرارة المرتفعة. تم اقتراح استخدام بوليميرات الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة. أثبتت هذه الإنزيمات أنها قابلة للحرارة وقادرة على تحمل العديد من دورات التفاعل. جعل استخدامها من الممكن تبسيط وأتمتة PCR. تم عزل واحدة من أول بوليميرات الحمض النووي المقاومة للحرارة من بكتيريا Thermus aquaticus ، التي تعيش في الينابيع الساخنة في حديقة يلوستون الوطنية ، وسميت Taq polymerase.
أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بسرعة العمود الفقري الرئيسي لمشروع الجينوم البشري. بشكل عام ، لا تختلف العملية عن تلك التي طورتها Mullis ، لقد كانت آلية فقط. لم نعد نعتمد على حشد من طلاب الدراسات العليا المكفوفين بصعوبة بالغة في سكب قطرات من السائل في أنابيب اختبار بلاستيكية. في المختبرات الحديثة التي تجري أبحاثًا وراثية جزيئية ، يتم تنفيذ هذا العمل على ناقلات آلية. تعمل روبوتات PCR المشاركة في مشروع تسلسلي ضخم مثل الجينوم البشري بلا هوادة مع كميات ضخمة من البوليميراز المقاوم للحرارة. غضب بعض العلماء العاملين في مشروع الجينوم البشري من الرسوم المرتفعة غير المعقولة التي يضيفها مالك براءة اختراع PCR ، العملاق الصناعي والصيدلاني الأوروبي هوفمان لاروش ، إلى تكلفة المواد الاستهلاكية.
كانت "البداية الدافعة" الأخرى هي طريقة تسلسل الحمض النووي نفسها. لم تعد الكيمياء الكامنة وراء هذه الطريقة جديدة في ذلك الوقت: اعتمد مشروع الجينوم البشري (HGP) نفس الطريقة المبتكرة التي طورها فريد سينجر في منتصف السبعينيات. كان الابتكار في نطاق ودرجة الأتمتة التي يمكن أن يحققها التسلسل.
تم تطوير التسلسل الآلي في الأصل في مختبر Lee Hood في Caltech. تخرج من المدرسة الثانوية في مونتانا ولعب كرة القدم الأمريكية كمهاجم. بفضل هود ، فاز الفريق ببطولة الولاية أكثر من مرة. كانت مهارات التفاعل الجماعي مفيدة له في مسيرته العلمية. كان مختبر هود يضم طاقمًا متنوعًا من الكيميائيين وعلماء الأحياء والمهندسين ، وسرعان ما أصبح مختبره رائدًا في الابتكار التكنولوجي.
في الواقع ، تم اختراع طريقة التسلسل التلقائي بواسطة Lloyd Smith و Mike Hunkapiller. اقترب مايك هانكابيلر ، الذي كان يعمل في مختبر هود ، من لويد سميث بطريقة تسلسل محسّنة من شأنها أن تلطخ كل نوع من أنواع القواعد بلون مختلف. يمكن لمثل هذه الفكرة أن تضاعف كفاءة عملية سانجر أربع مرات. ينتج عن تسلسل سانجر في كل من أنابيب الاختبار الأربعة (وفقًا لعدد القواعد) بمشاركة بوليميراز الحمض النووي مجموعة فريدة من قليل النوكليوتيدات بأطوال مختلفة ، بما في ذلك التسلسل التمهيدي. بعد ذلك ، تمت إضافة الفورماميد إلى الأنابيب لفصل السلاسل ، وتم إجراء الرحلان الكهربائي في هلام بولي أكريلاميد في أربعة ممرات. في متغير Smith و Hunkapiller ، يتم تمييز ديديوكسينوكليوتيدات بأربعة أصباغ مختلفة ويتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوب واحد. بعد ذلك ، أثناء الرحلان الكهربي للهلام متعدد الأكريلاميد ، يثير شعاع الليزر الموجود في موقع معين في الجل نشاط الأصباغ ، ويحدد الكاشف أي نوكليوتيد يهاجر حاليًا عبر الهلام. في البداية ، كان سميث متشائمًا - فقد كان يخشى أن يؤدي استخدام جرعات منخفضة جدًا من الصبغة إلى حقيقة أن مناطق النوكليوتيدات لا يمكن تمييزها. ومع ذلك ، بعد أن اكتسب فهمًا ممتازًا لتكنولوجيا الليزر ، سرعان ما وجد طريقة للخروج باستخدام أصباغ الفلوروكروم الخاصة التي تتألق عند تعرضها لإشعاع الليزر.
(النسخة الكاملة - 4,08 ميغا بايت) بصمة صغيرة: تسلسل الحمض النووي الذي تم فك تشفيره باستخدام جهاز تسلسل تلقائي ، تم الحصول عليه من آلة التسلسل التلقائي. كل لون يتوافق مع إحدى القواعد الأربع
في الإصدار الكلاسيكي من طريقة سانجر ، يعمل أحد خيوط الحمض النووي الذي تم تحليله كقالب لتركيب خيط تكميلي بواسطة إنزيم بوليميريز الحمض النووي ، ثم يتم فرز تسلسل شظايا الحمض النووي حسب الحجم في الهلام. كل جزء ، والذي يتم تضمينه في الحمض النووي أثناء التركيب ويسمح بالتصوير اللاحق لنواتج التفاعل ، يتم تمييزه بصبغة الفلورسنت المقابلة للقاعدة النهائية (تمت مناقشة هذا في ص 124) ؛ لذلك ، سيكون تألق هذا الجزء معرّفًا لهذه القاعدة. ثم يبقى فقط لإجراء كشف وتصور نواتج التفاعل. يتم تحليل النتائج بواسطة الكمبيوتر وعرضها على شكل سلسلة من القمم الملونة المقابلة لأربعة نيوكليوتيدات. ثم يتم نقل المعلومات مباشرة إلى نظام معلومات الكمبيوتر ، مما يلغي عملية إدخال البيانات التي تستغرق وقتًا طويلاً وأحيانًا تكون مؤلمة مما جعل التسلسل صعبًا للغاية.
»لمزيد من المعلومات حول الكتاب ، يرجى زيارة
»
»
ل Khabrozhiteli خصم 25٪ على الكوبون - PCR
المصدر: www.habr.com