Amerikalı kimya üzrə Nobel mükafatı laureatı Kari Mullis 74 yaşında Kaliforniyada vəfat edib. Həyat yoldaşının sözlərinə görə, ölüm avqustun 7-də baş verib. Səbəb pnevmoniyaya bağlı ürək və tənəffüs çatışmazlığıdır.
Onun biokimyaya hansı töhfələr verdiyi və nə üçün Nobel mükafatı aldığını bizə DNT molekulunun kəşfçisi Ceyms Uotson özü deyəcək.
James Watson, Andrew Berry, Kevin Davisin kitabından bir parça
DNT. Genetik inqilabın tarixi
Fəsil 7. İnsan genomu. həyat ssenarisi
...
Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) 1983-cü ildə Cetus üçün işləyən biokimyaçı Cary Mullis tərəfindən icad edilmişdir. Bu reaksiyanın kəşfi olduqca diqqətəlayiq idi. Mullis daha sonra xatırlayırdı: “1983-cü ilin aprelində bir cümə gecəsi mənə işıq saçdı. Mən ay işığında dolanbac dağ yolu ilə, qırmızı ağacların kənarına, Şimali Kaliforniyaya gedirdim. Təəccüblüdür ki, məhz bu vəziyyətdə onun ilhamla ziyarətə getməsidir. Və Şimali Kaliforniyada fikirlərə kömək edən xüsusi yolların olması heç də belə deyil; sadəcə olaraq onun dostu bir dəfə Mullisin ikitərəfli buzlu yolda ehtiyatsızcasına tələsdiyini gördü və bu, onu heç narahat etmədi. Bir dostu New York Times-a dedi: “Mullis qırmızı ağaca çırpılanda öləcəyini zənn etdi. Buna görə də, yol boyu qırmızı ağac yoxdursa, maşın sürərkən heç nədən qorxmur. Yol boyu qırmızı ağacların olması Mullisi diqqətini cəmləməyə məcbur etdi və ... budur, fikir. 1993-cü ildə etdiyi ixtiraya görə Mullis kimya üzrə Nobel mükafatı aldı və o vaxtdan bəri hərəkətləri daha da qəribələşdi. Məsələn, o, QİÇS-in HİV-ə aidiyyatı olmadığına dair revizionist nəzəriyyənin tərəfdarıdır ki, bu da onun öz reputasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə sarsıtdı və həkimlərə müdaxilə etdi.
PCR olduqca sadə bir reaksiyadır. Bunu həyata keçirmək üçün bizə lazım olan DNT fraqmentinin müxtəlif zəncirlərinin əks uclarını tamamlayan iki kimyəvi sintez edilmiş primer lazımdır. Primerlər hər biri təqribən 20 əsas cüt uzunluğunda olan tək zəncirli DNT-nin qısa uzantılarıdır. Primerlərin özəlliyi ondan ibarətdir ki, onlar DNT-nin gücləndirilməli olan bölmələrinə, yəni DNT şablonuna uyğundur.
(Şəkil tıklanabilir) Carey Mullis, PCR-in ixtiraçısı
PCR-in spesifikliyi şablon və primerlər, qısa sintetik oliqonukleotidlər arasında tamamlayıcı komplekslərin formalaşmasına əsaslanır. Astarların hər biri ikiqat zəncirli şablonun zəncirlərindən birinə tamamlayıcıdır və gücləndirilmiş bölgənin başlanğıcını və sonunu məhdudlaşdırır. Əslində, əldə edilən "matris" bütöv bir genomdur və bizim məqsədimiz ondan maraq fraqmentlərini təcrid etməkdir. Bunun üçün DNT zəncirlərini ayırmaq üçün ikiqat zəncirli DNT şablonu bir neçə dəqiqə ərzində 95 °C-ə qədər qızdırılır. Bu mərhələ denatürasiya adlanır, çünki DNT-nin iki zəncirindəki hidrogen bağları qırılır. Tellər ayrıldıqda, astarların tək telli şablona bağlanmasına imkan vermək üçün temperatur aşağı salınır. DNT polimeraza nukleotidlər zəncirinin bir seqmentinə bağlanaraq DNT replikasiyasına başlayır. DNT polimeraza fermenti primer və ya surət şablonu kimi primerdən istifadə edərək şablon zəncirini təkrarlayır. Birinci dövrə nəticəsində biz DNT-nin müəyyən bir hissəsinin çoxlu ardıcıl ikiqatını əldə edirik. Sonra bu proseduru təkrarlayırıq. Hər dövrədən sonra ikiqat miqdarda hədəf sayt əldə edirik. İyirmi beş PCR dövründən sonra (yəni iki saatdan az müddətdə) orijinaldan 225 dəfə çox olan DNT bölməsi bizi maraqlandırır (yəni biz onu təxminən 34 milyon dəfə gücləndirdik). Əslində, girişdə primerlərin, şablon DNT, DNT polimeraza fermentinin və sərbəst A, C, G və T əsaslarının qarışığı əldə etdik, xüsusi reaksiya məhsulunun miqdarı (primerlərlə məhdudlaşır) eksponent olaraq artır və " uzun” DNT nüsxələri xəttidir, buna görə də reaksiyada məhsullar üstünlük təşkil edir.
İstədiyiniz DNT bölgəsinin gücləndirilməsi: polimeraza zəncirvari reaksiya
PCR-in ilk günlərində əsas problem ondan ibarət idi ki, hər bir qızdırma-soyutma dövründən sonra reaksiya qarışığına DNT polimerazı əlavə etmək lazım idi, çünki o, 95 °C-də təsirsiz hala gətirildi. Buna görə də hər 25 dövrədən əvvəl onu yenidən əlavə etmək lazım idi. Reaksiya proseduru nisbətən səmərəsiz idi, çox vaxt və polimeraza fermenti tələb olunurdu və material çox bahalıdır. Xoşbəxtlikdən Ana Təbiət köməyə gəldi. Bir çox heyvan 37 ° C-dən çox yüksək temperaturda rahat hiss edir. 37°C bizim üçün niyə bu qədər vacibdir? Çünki bu temperatur ilkin olaraq PCR üçün polimeraza fermenti alınmış E.coli üçün optimaldır. Təbiətdə elə mikroorqanizmlər var ki, onların zülalları milyonlarla illik təbii seleksiya nəticəsində yüksək temperaturlara daha davamlı olub. Termofil bakteriyaların DNT polimerazalarından istifadə etmək təklif edilmişdir. Bu fermentlər termostabil olduqlarını sübut etdilər və bir çox reaksiya dövrlərinə tab gətirə bildilər. Onların istifadəsi PCR-ni sadələşdirməyə və avtomatlaşdırmağa imkan verdi. İlk termostabil DNT polimerazalarından biri Yellowstone Milli Parkının isti bulaqlarında yaşayan Thermus aquaticus bakteriyasından təcrid olunmuş və ona Taq polimeraza adı verilmişdir.
PCR tez bir zamanda İnsan Genomu Layihəsinin əsas işçi qüvvəsinə çevrildi. Ümumiyyətlə, proses Mullisin hazırladığı prosesdən fərqlənmir, sadəcə avtomatlaşdırılmışdır. Biz artıq gözləri kor olan aspirantların sıxlıqla plastik sınaq borularına maye damcıları tökməsindən asılı deyildik. Molekulyar genetik tədqiqatlar aparan müasir laboratoriyalarda bu iş robot konveyerlərdə yerinə yetirilir. İnsan Genomu qədər kütləvi bir ardıcıllıq layihəsində iştirak edən PCR robotları böyük həcmdə istiliyədavamlı polimeraza ilə amansız işləyirlər. İnsan Genomu Layihəsində çalışan bəzi alimlər PCR patentinin sahibi, Avropanın sənaye və əczaçılıq nəhəngi Hoffmann-LaRoche-nin istehlak materiallarının qiymətinə əlavə etdiyi əsassız yüksək ödənişlərdən qəzəblənib.
Başqa bir "sürücü başlanğıcı" DNT sıralama metodunun özü idi. Bu metodun arxasında duran kimya o zaman artıq yenilik deyildi: İnsan Genomu Layihəsi (HGP) 1970-ci illərin ortalarında Fred Senger tərəfindən hazırlanmış eyni dahiyanə metodu mənimsəmişdi. Yenilik, ardıcıllığın əldə edə biləcəyi miqyasda və avtomatlaşdırma dərəcəsində idi.
Avtomatlaşdırılmış ardıcıllıq ilk olaraq Caltech-də Li Hudun laboratoriyasında hazırlanmışdır. Montanada orta məktəbi bitirib və hücumçu kimi Amerika futbolu oynayıb; Hood sayəsində komanda bir dəfədən çox dövlət çempionluğunu qazandı. Komanda ilə qarşılıqlı əlaqə bacarıqları elmi karyerasında ona faydalı oldu. Hoodun laboratoriyasında kimyaçılar, bioloqlar və mühəndislərdən ibarət rəngarəng bir ekipaj yerləşdi və onun laboratoriyası tezliklə texnoloji innovasiyalarda lider oldu.
Əslində, avtomatik ardıcıllıq metodu Lloyd Smith və Mike Hunkapiller tərəfindən icad edilmişdir. Daha sonra Hoodun laboratoriyasında işləyən Mayk Hunkapiller Lloyd Smith-ə hər növ bazanı fərqli rəngə boyayacaq təkmil ardıcıllıq metodu ilə yaxınlaşdı. Belə bir fikir Sanger prosesinin səmərəliliyini dörd dəfə artıra bilər. DNT polimerazanın iştirakı ilə dörd sınaq borusunun hər birində (əsasların sayına görə) Sangerin ardıcıllığı, primer ardıcıllığı da daxil olmaqla, müxtəlif uzunluqlu oliqonukleotidlərin unikal dəstini əmələ gətirir. Sonra zəncirləri ayırmaq üçün borulara formamid əlavə edildi və dörd zolaqda poliakrilamid geldə elektroforez aparıldı. Smith və Hunkapiller variantında dideoksinukleotidlər dörd müxtəlif boya ilə etiketlənir və PCR bir boruda aparılır. Daha sonra, poliakrilamid gel elektroforezi zamanı gelin müəyyən yerində lazer şüası boyaların aktivliyini həyəcanlandırır və detektor hazırda hansı nukleotidin gel vasitəsilə miqrasiya etdiyini müəyyən edir. Əvvəlcə Smit pessimist idi - o, boyanın ultra aşağı dozalarının istifadəsinin nukleotid bölgələrinin fərqlənə bilməyəcəyinə səbəb olacağından qorxurdu. Bununla belə, lazer texnologiyasını mükəmməl başa düşərək, lazer şüalanmasına məruz qaldıqda flüoresanlaşan xüsusi flüoroxrom boyalarından istifadə edərək tezliklə çıxış yolu tapdı.
(Tam versiyası - 4,08 MB) Kiçik çap: DNT ardıcıllığı avtomatik sekvensatordan istifadə edərək deşifrə edilmiş, avtomatik ardıcıllıq maşınından alınmışdır. Hər bir rəng dörd əsasdan birinə uyğundur
Sanger metodunun klassik versiyasında təhlil edilən DNT-nin zəncirlərindən biri DNT polimeraza fermenti tərəfindən tamamlayıcı zəncir sintezi üçün şablon rolunu oynayır, sonra DNT fraqmentlərinin ardıcıllığı geldə ölçülərinə görə çeşidlənir. Sintez zamanı DNT-yə daxil olan və reaksiya məhsullarının sonradan vizuallaşdırılmasına imkan verən hər bir fraqment terminal bazaya uyğun olan flüoresan boya ilə etiketlənir (bu, s. 124-də müzakirə edilmişdir); buna görə də bu fraqmentin flüoresansı bu baza üçün identifikator olacaqdır. Sonra yalnız reaksiya məhsullarının aşkarlanması və vizuallaşdırılmasını həyata keçirmək qalır. Nəticələr kompüter tərəfindən təhlil edilir və dörd nukleotidə uyğun gələn rəngli zirvələrin ardıcıllığı kimi təqdim olunur. Daha sonra məlumat birbaşa kompüterin informasiya sisteminə ötürülür ki, bu da ardıcıllığı çox çətinləşdirən vaxt aparan və bəzən ağrılı məlumatların daxil edilməsi prosesini aradan qaldırır.
» Kitab haqqında ətraflı məlumat üçün müraciət edin
»
»
Khabrozhiteli üçün kuponda 25% endirim - PCR
Mənbə: www.habr.com