У Каліфорніі ва ўзросце 74 гадоў памёр амерыканскі нобелеўскі лаўрэат па хіміі Кэры Муліс. Па словах яго жонкі, смерць наступіла 7 жніўня. Прычына - сардэчная і дыхальная недастатковасць з-за пнеўманіі.
Пра тое, які ўклад ён унёс у біяхімію і за што атрымаў Нобелеўскую прэмію, нам раскажа сам Джэймс Уотсан – першаадкрывальнік малекулы ДНК.
Урывак з кнігі Джэймса Уотсана, Эндру Бэры, Кевіна Дэвіса
ДНК. Гісторыя генетычнай рэвалюцыі
Кіраўнік 7. Геном чалавека. Сцэнар жыцця
...
Полімеразная ланцуговая рэакцыя (ПЦР) была вынайдзена ў 1983 годзе біяхімікам Кэры Мулісам, які працаваў у кампаніі Cetus. Адкрыццё гэтай рэакцыі было вельмі характэрным. Пазней Мулліс успамінаў: «Аднойчы пятнічным вечарам у красавіку 1983 года мяне нібы азарыла. Я быў за рулём, каціў па залітай месячным святлом звілістай горнай дарозе ў Паўночную Каліфорнію, край секвойных лясоў». Уражвае, што менавіта ў такой сітуацыі яго наведала натхненне. І справа зусім не ў тым, што на поўначы Каліфорніі асаблівыя дарогі, якія спрыяюць азарэнню; проста яго адзін аднойчы бачыў, як Муліс безразважна імчаўся па абледзянелай дарозе з двухбаковым рухам і гэта яго зусім не бянтэжыла. Сябар распавёў New York Times наступнае: «Мулісу здалося, што ён загіне, урэзаўшыся ў секвою. Таму ён нічога не баіцца за рулём, калі ўздоўж дарогі не растуць секвоі». Наяўнасць секвай уздоўж дарогі прымушала Муліса засяродзіцца і… вось яно, азарэнне. За сваё вынаходніцтва ў 1993 годзе Муліс атрымаў Нобелеўскую прэмію па хіміі і з таго часу стаў яшчэ больш дзіўным у сваіх учынках. Напрыклад ён з'яўляецца прыхільнікам рэвізіянісцкай тэорыі аб тым, што СНІД не звязаны з ВІЧ, чым значна падарваў уласную рэпутацыю і перашкодзіў урачам.
ПЦР - даволі простая рэакцыя. Для яе правядзення нам патрабуецца два хімічна сінтэзаваных праймера, камплементарныя процілеглым канцам розных ланцугоў патрабаванага фрагмента ДНК. Праймер - гэта кароткія ўчасткі однонитчатой ДНК, кожны прыкладна па 20 пар падстаў у даўжыню. Асаблівасць праймераў такая, што яны адпавядаюць участкам ДНК, якія патрабуецца ампліфікаваць, гэта значыць ДНК-матрыцы.
(Выява клікабельна) Кэры Муліс, вынаходнік ПЦР
Спецыфічнасць ПЦР заснавана на адукацыі камплементарных комплексаў паміж матрыцай і праймер, кароткімі сінтэтычнымі алігануклеатыдаў. Кожны з праймераў камлементарны адной з ланцугоў двуцепочечной матрыцы і абмяжоўвае пачатак і канец які ампліфікуецца ўчастку. Фактычна атрыманая «матрыца» уяўляе сабой суцэльны геном, і наша мэта - вылучыць з яе цікавяць нас фрагменты. Для гэтага двухланцужковую ДНК-матрыцу награваюць да 95 ° C на некалькі хвілін, каб ланцугі ДНК разышліся. Гэтая стадыя называецца дэнатурацыяй, бо разбураюцца вадародныя сувязі паміж двума ланцугамі ДНК. Калі ланцугі разышліся, тэмпературу паніжаюць, каб праймер маглі звязацца з одноцепочечной матрыцай. ДНК-полимераза пачынае рэплікацыю ДНК, злучаючыся з адрэзкам ланцуга нуклеатыдаў. Фермент ДНК-полимераза рэплікуе матрычны ланцуг, выкарыстаючы праймер у якасці затраўкі або прыкладу для капіявання. У выніку першага цыклу атрымліваем шматразовае паслядоўнае падваенне вызначанага ўчастку ДНК. Далей мы паўтараем гэтую працэдуру. Пасля кожнага цыклу атрымліваем участак-мішэнь у падвойнай колькасці. Праз дваццаць пяць цыклаў ПЦР (гэта значыць менш чым праз дзве гадзіны) маем які цікавіць нас участак ДНК у колькасці, у 225 разу які перавышае зыходнае (гэта значыць мы ампліфікавалі яго прыкладна ў 34 мільёна разоў). Фактычна на ўваходзе ў нас атрымлівалася сумесь з праймераў, матрычнай ДНК, фермента ДНК-полимеразы і вольных падстаў А, Ц, Г і Т, колькасць спецыфічнага прадукта рэакцыі (абмежаванага праймерамі) расце экспанентна, а колькасць «доўгіх» дзід ДНК лінейна, таму ў прадуктах рэакцыі дамінуе.
Ампліфікацыя патрэбнага ўчастка ДНК: палімеразнай ланцуговая рэакцыя
На світанку выкарыстання ПЦР асноўная праблема складалася ў наступным: пасля кожнага цыклу награвання-астуджэнні прыходзілася дадаваць у рэакцыйную сумесь ДНК-полимеразу, бо яна инактивировалась пры тэмпературы 95 °C. Таму трэба было нанава дадаваць яе перад кожным з 25 цыклаў. Працэдура правядзення рэакцыі была параўнальна неэфектыўнай, патрабавала шмат часу і фермента полимеразы, а матэрыял гэта вельмі нятанны. На шчасце, на дапамогу прыйшла матухна-прырода. Многія жывёлы адчуваюць сябе камфортна пры тэмпературы значна вышэй за 37 °C. А чаму для нас стала важнай лічба 37 °C? Гэта адбылося таму, што дадзеная тэмпература з'яўляецца аптымальнай для E. coli, з якой зыходна атрымлівалі фермент полимеразу для ПЦР. У прыродзе сустракаюцца мікраарганізмы, чые вавёркі за мільёны гадоў натуральнага адбору сталі больш устойлівымі да дзеяння высокіх тэмператур. Было прапанавана выкарыстоўваць ДНК-полимеразы з тэрмафільных бактэрый. Гэтыя ферменты аказаліся термостабильными і былі здольныя вытрымліваць мноства цыклаў рэакцыі. Іх выкарыстанне дазволіла спрасціць і аўтаматызаваць правядзенне ПЦР. Адна з першых термостабильных ДНК-полімераз была выдзелена з бактэрыі Thermus aquaticus, якая жыве ў гарачых крыніцах Елаўстонскага нацыянальнага парку, і названа Taq-полімеразай.
ПЦР хутка ператварылася ў галоўны працоўны конік праекту «Генам чалавека». Увогуле, працэс не адрозніваецца ад распрацаванага Мулісам, проста ён быў аўтаматызаваны. Мы больш не залежалі ад натоўпу падслепаватых аспірантаў, якія карпатліва пералівалі кропелькі вадкасці ў пластыкавыя прабіркі. У сучасных лабараторыях, якія ажыццяўляюць малекулярна-генетычныя даследаванні, гэтая праца выконваецца на рабатызаваных канвеерах. ПЦР-робаты, занятыя ў гэтак маштабным праекце па секвеніравання, як «Геном чалавека», няўмольна працуюць з велізарнымі аб'ёмамі тэрмаўстойлівай полимеразы. Некаторыя навукоўцы, якія працуюць у праекце "Геном чалавека", былі абураныя неапраўдана высокімі адлічэннямі, якія дадае да кошту расходных матэрыялаў уладальнік патэнта на ПЦР, еўрапейскі індустрыяльна-фармацэўтычны гігант Hoffmann-LaRoche.
Іншым «рухаючым пачаткам» стаў сам метад секвенавання ДНК. Хімічная аснова гэтага метаду ў той час ужо не была навінкай: Міждзяржаўны праект "Генам чалавека" (HGP) узяў на ўзбраенне той жа самы мудрагелісты метад, што яшчэ ў сярэдзіне 1970-х гадоў распрацаваў Фрэд Сенгер. Інавацыя ж складалася ў маштабе і ступені аўтаматызацыі, якіх удалося дасягнуць пры секвенаванні.
Аўтаматычнае секвеніраванне зыходна распрацоўвалася ў лабараторыі Лі Худа ў Каліфарнійскім тэхналагічным інстытуце. Ён заканчваў школу ў штаце Мантана і гуляў у амерыканскі футбол на пазіцыі нападаючага; дзякуючы Худу каманда не раз выйгравала чэмпіянат штата. Навыкі каманднага ўзаемадзеяння спатрэбіліся яму і ў навуковай кар'еры. У лабараторыі Худа працавала стракатая кампанія хімікаў, біёлагаў і інжынераў, і неўзабаве яго лабараторыя выйшла ў лідэры па частцы тэхналагічных інавацый.
Фактычна метад аўтаматычнага секвеніравання вынайшлі Лойд Сміт і Майк Хункапілер. Майк Хункапілер, які тады працаваў у лабараторыі Худа, звярнуўся да Лойда Сміта, прапанаваўшы яму ўдасканалены метад секвеніравання, у якім падставы кожнага тыпу афарбоўваліся б кожны ў свой колер. Такая ідэя магла ў чатыры разы павысіць эфектыўнасць сенгераўскага працэсу. У Сенгера пры секвеніравання ў кожнай з чатырох прабірак (па ліку падстаў) пры ўдзеле ДНК-полимеразы утворыцца ўнікальны набор олигонуклеотидов рознай даўжыні, якія ўключаюць праймерную паслядоўнасць. Далей у прабіркі дадавалі формамід для разыходжання ланцугоў і праводзілі электрафарэз у поліакрыламідным гелі на чатырох дарожках. У варыянце Сміта і Хункапілера дыдэзаксінуклеатыдаў пазначаюць чатырма рознымі фарбавальнікамі і праводзяць ПЦР у адной прабірцы. Затым падчас электрафарэзу ў полиакриламидном гелі прамень лазера ў вызначаным месцы геля ўзбуджае актыўнасць фарбавальнікаў, і дэтэктар вызначае, які нуклеатыд у сапраўдны момант мігруе праз гель. Спачатку Сміт быў настроены песімістычна - ён баяўся, што выкарыстанне звышмалых доз фарбавальніка прывядзе да таго, што нуклеатыдныя ўчасткі будуць неадметныя. Аднак, цудоўна разбіраючыся ў лазерных тэхналогіях, ён неўзабаве знайшоў выхад са становішча, выкарыстоўваючы спецыяльныя флюарахромныя фарбавальнікі, якія флуарэсцуюць пад дзеяннем лазернага выпраменьвання.
(Поўная версія - 4,08 МБ) Дробным шрыфтам: паслядоўнасць ДНК, расшыфраваная з выкарыстаннем аўтаматычнага секвенатара, атрыманая з апарата для аўтаматычнага секвеніравання. Кожнаму колеру адпавядае адна з чатырох падстаў
У класічным варыянце метаду Сэнгера адна з ланцужкоў аналізаванай ДНК выступае ў якасці матрыцы для сінтэзу камплементарнага ланцужка ферментам ДНК-полимеразой, затым паслядоўнасць фрагментаў ДНК сартуецца ў гелі па памеры. Кожны фрагмент, які ўключаецца ў склад ДНК падчас сінтэзу і дазваляе пасля візуалізаваць прадукты рэакцыі, пазначаецца флуарэсцэнтным фарбавальнікам, які адпавядае тэрмінальнай падставе (аб гэтым гаварылася на с. 124); такім чынам, флюарэсцэнцыя гэтага фрагмента будзе ідэнтыфікатарам для дадзенай падставы. Затым застаецца толькі правесці дэтэкцыю і візуалізаваць прадукты рэакцыі. Вынікі аналізуюць з дапамогай кампутара і прадстаўляюць у выглядзе паслядоўнасці рознакаляровых пікаў, якія адпавядаюць чатыром нуклеатыдаў. Далей інфармацыя перадаецца непасрэдна ў інфармацыйную сістэму кампутара, што выключае затратны па часе і часам пакутлівы працэс уводу дадзеных, які вельмі ўскладняў секвеніраванне.
» Больш падрабязна з кнігай можна азнаёміцца на
»
»
Для Хаброжыцеляў зніжка 25% па купоне ПЦР
Крыніца: habr.com