На 74-годишна възраст почина американският нобелов лауреат по химия Кери Мулис в Калифорния. Според думите на съпругата му, смъртта е настъпила на 7 август. Причината е сърдечна и дихателна недостатъчност поради пневмония.
За приноса му в биохимията и за това, че е получил Нобелова награда, ще ни разкаже самият Джеймс Уотсън — откривателят на молекулата на ДНК.
Извадка от книгата на Джеймс Уотсън, Андрю Бери, Кевин Дейвис
ДНК. История на генетичната революция
Глава 7. Геномът на човека. Сценарий на живота
…
Полимеразната верижна реакция (ПЦР) е изобретена през 1983 година от биохимика Кери Мулис, който е работил в компанията Cetus. Откритието на тази реакция е било доста забележително. По-късно Мулис споменава: «Една вечер в петък през април 1983 г. прозрението ми дойде. Бях зад волана, шофирайки по лунно осветената завойна планинска пътека в Северна Калифорния, в района на секвойните гори». Впечатляващо е, че именно в такава ситуация вдъхновението го е посетило. И не става въпрос за това, че на север в Калифорния има специални пътища, които предизвикват прозрение; просто един негова приятел веднъж е видял как Мулис безразсъдно минава по заледен път с двупосочно движение и това не го е смущавало. Приятелят казал на New York Times следното: «На Мулис му се е струвало, че ще загине, като се удари в секвойя. Затова не се страхува да шофира, стига по пътя да няма секвойи». Наличието на секвойи до пътя карало Мулис да се фокусира и... ето го прозрението. За своето изобретение Мулис получава Нобелова награда по химия през 1993 година и оттогава става още по-странен в своите постъпки. Например, той е привърженик на ревизионистката теория, че СПИН не е свързан с ВИЧ, с което значително подкопава собствената си репутация и затруднява лекарите.
ПЦР е доста проста реакция. За нейното провеждане се нуждаем от два химически синтезирани праймера, комплементарни на противоположните краища на различни вериги от искания фрагмент на ДНК. Праймерите са кратки участъци от една верига ДНК, всеки с дължина около 20 двойки основи. Особеност на праймерите е, че те съответстват на участъци от ДНК, които трябва да бъдат амплифицирани, т.е. ДНК матрица.
(Изображението е кликаемо) Кери Мулис, изобретателят на ПЦР
Специфичността на PCR е основана на образуването на комплементарни комплекси между матрицата и праймерите, които са кратки синтетични олигонуклеотиди. Всеки от праймерите е комплементарен на една от веригите на двуверижната матрица и ограничава началото и края на амплифицирания участък. Фактически получената „матрица“ представлява цялостен геном, а нашата цел е да изолираме интересуващите ни фрагменти от него. За целта двуверижната ДНК-матрица се нагрява до 95 °C за няколко минути, за да се разделят веригите на ДНК. Тази стъпка се нарича денатурация, тъй като хидрогенните връзки между двете вериги на ДНК се разрушават. Когато веригите се разделят, температурата се понижава, за да могат праймерите да се свържат с едноверижната матрица. ДНК-полимеразата започва репликацията на ДНК, свързвайки се с участък от веригата на нуклеотидите. Ферментът ДНК-полимераза репликира матричната верига, използвайки праймерите като начало или пример за копиране. В резултат на първия цикъл получаваме множество последователни удвоявания на определен участък от ДНК. След това повтаряме тази процедура. След всеки цикъл получаваме целевия участък в двойно количество. След двадесет и пет цикъла на PCR (тоест по-малко от два часа) имаме интересуващия ни участък от ДНК в количество, 225 пъти по-голямо от първоначалното (тоест сме го амплифицирали приблизително 34 милиона пъти). Фактически на входа имаме смес от праймери, матрична ДНК, фермент ДНК-полимераза и свободни основи А, Ц, Г и Т, количеството на специфичния продукт на реакцията (ограничен от праймерите) нараства експоненциално, а количеството на „дългите“ копия ДНК линейно, поради което продуктите на реакцията доминират.
Амплификация на нужния участък от ДНК: полимеразна верижна реакция
В началото на използването на ПЦР основният проблем беше следният: след всеки цикъл на нагряване-охлаждане трябваше да се добавя ДНК полимераза в реакционната смес, тъй като тя се инактивираше при температура от 95 °C. Затова трябваше да я добавяме отново преди всеки от 25-те цикъла. Процедурата за провеждане на реакцията беше сравнително неефективна, изискваше много време и полимеразен ензим, а материалът беше доста скъп. За щастие, природата дойде на помощ. Много животни се чувстват удобно при температури, значително над 37 °C. А защо 37 °C стана важна цифра за нас? Това се случи, защото тази температура е оптималната за E. coli, от която първоначално беше извлечен полимеразният ензим за ПЦР. В природата има микроорганизми, чиито белтъци след милиони години естествена селекция станаха по-устойчиви на високи температури. Предложено беше да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и можеха да понасят множество реакционни цикли. Използването им позволи опростяване и автоматизиране на провеждането на ПЦР. Един от първите термостабилни ДНК полимерази беше извлечен от бактерията Thermus aquaticus, обитаваща в горещи извори на националния парк Йелоустоун и беше наречен Taq полимераза.
ПЦР бързо се превърна в основен работен кон на проекта "Човешкият геном". По принцип процесът не се различава от този, разработен от Мулис, просто беше автоматизиран. Вече не зависехме от тълпата от неуките аспиранти, които внимателно наливат капки течност в пластмасови епруветки. В съвременните лаборатории, провеждащи молекулярно-генетични изследвания, тази работа се извършва на роботизирани конвейери. ПЦР роботи, заети в толкова мащабен проект за секвениране, като "Човешкия геном", неумолимо работят с огромни обеми термоустойчив полимераз. Някои учени, работещи по проекта "Човешкия геном", бяха възмутени от неоправдано високите такси, които добавя към цената на консумативите притежателят на патента за ПЦР, европейският индустриално-фармацевтичен гигант Hoffmann-LaRoche.
Другото "движение" беше самият метод на секвенциониране на ДНК. Химическата основа на този метод по онова време вече не беше новост: Междуправителственият проект "Геном на човека" (HGP) заимства същия хитроумен метод, който още в средата на 70-те години разработи Фред Сенгер. Иновацията се състоеше в мащаба и степента на автоматизация, които успяха да постигнат при секвенционирането.
Автоматичното секвенциониране първоначално беше разработвано в лабораторията на Ли Худ в Калифорнийския технологичен институт. Той завърши училище в щата Монтана и играеше американски футбол на позицията нападател; благодарение на Худ отборът неведнъж печелеше шампионата на щата. Уменията за работа в екип му помогнаха и в научната кариера. В лабораторията на Худ работеше разнообразна група от химици, биолози и инженери, и скоро лабораторията му стана лидер в областта на технологичните иновации.
Всъщност методът за автоматично секвениране е изобретен от Лойд Смит и Майк Хункапилер. Майк Хункапилер, който тогава работел в лабораторията на Хъд, се обърнал към Лойд Смит с предложение за усъвършенстван метод на секвениране, при който всеки тип основа да бъде оцветен в свой цвят. Тази идея можела да увеличи ефикасността на процеса на Сенгер до четири пъти. При секвенирането на Сенгер, в четирите пробирки (по броя на основите) и с участието на ДНК-полимераза се образува уникален набор от олигонуклеотиди с различна дължина, включващи примери последователности. След това в пробирките се добавя формамид за разплита на веригите и се провежда електрофореза в полиакриламиден гел на четири канала. В варианта на Смит и Хункапилер дидезоксинуклеотидите се етикетират с четири различни багрила и се провежда ПЦР в една пробирка. По време на електрофорезата в полиакриламидния гел, лазерен лъч в определена част от гела задейства активността на багрилата, а детекторът установява кой нуклеотид в момента мигрира през гела. Сперва Смит бил настроен песимистично - страхувал се, че използването на свръхмалки дози багрило ще доведе до това, че нуклеотидните фрагменти да не се различават. Обаче, отлично познавайки лазерните технологии, той бързо намерил решение, използвайки специални флуорохромни багрила, които флуоресцират под въздействието на лазерно излъчване.
(Пълна версия — 4,08 МБ) С дребен шрифт: последователността на ДНК, дешифрирана с помощта на автоматичен секвенатор, получена от апарата за автоматично секвениране. На всеки цвят съответства една от четирите основи
В класическия вариант на метода на Сенгер, една от веригите на анализираната ДНК служи като матрица за синтез на комплементарна верига от ензима ДНК полимераза. След това последователността на фрагментите на ДНК се сортира в гел по размер. Всеки фрагмент, който се включва в ДНК по време на синтеза и позволява последваща визуализация на продуктите на реакцията, се маркира с флуоресцентен оцветител, съответстващ на терминалната основа (както бе споменато на с. 124); следователно флуоресценцията на този фрагмент ще служи като идентификатор за съответната база. След това остават само детекцията и визуализацията на продуктите на реакцията. Резултатите се анализират с помощта на компютър и се представят под формата на последователност от разноцветни пикове, които съответстват на четирите нуклеотида. След това информацията се предава директно на информационната система на компютъра, което изключва времето и често мъчителния процес на въвеждане на данни, който значително усложняваше секвенирането.
» Можете да се запознаете по-подробно с книгата на
»
»
За Хаброжителите отстъпка 25% с купона — ПЦР
Източник: habr.com
