В Калифорния на 74 години почина американският носител на Нобелова награда по химия Кари Муллис. Според съпругата му, смъртта е настъпила на 7 август. Причината е сърдечна и дихателна недостатъчност поради пневмония.
За приноса му в биохимията и защо е получил Нобелова награда ще ни разкаже самият Джеймс Уотсън — откривателят на молекулата ДНК.
Извадка от книгата на Джеймс Уотсън, Андрю Бери, Кевин Дейвис
ДНК. История на генетичната революция
Глава 7. Геномът на човека. Сценарий на живота
…
Полимеразната верижна реакция (ПЦР) е изобретена през 1983 година от биохимика Кари Муллис, работил в компанията Cetus. Откритията на тази реакция са забележителни. По-късно Муллис споделя: «Една петъчна вечер през април 1983 година ме осени гениалната идея. Бях зад волана, карайки по осветената от луната извита планинска пътека в Северна Калифорния, край секвоите». Впечатляващо е, че именно в такава ситуация го е посетило вдъхновението. И не е заради това, че на север в Калифорния пътищата са специални и предразполагат към осенение; просто негов приятел веднъж е видял как Муллис безразсъдно се е носил по заледена пътека с двойно движение, което изобщо не го е смущавало. Приятелят му разказа на New York Times: «На Муллис му се е стори, че ще загине, блъскайки се в секвоя. Затова той не се страхува, когато шофира, ако покрай пътя няма секвои». Наличието на секвои покрай пътя е карало Муллис да се съсредоточи и… ето го, вдъхновението. За изобретението си през 1993 година Муллис получава Нобелова награда по химия и оттогава става още по-странен в постъпките си. Например, той е привърженик на ревизионистката теория, че СПИН не е свързан с ХИВ, което значително подкопа собствената му репутация и затрудни лекарите.
ПЦР — доста проста реакция. За нейното провеждане са нужни два химически синтезирани праймера, комплементарни на противоположните краища на различни вериги от изисквания фрагмент на ДНК. Праймерите са кратки участъци от едноверижна ДНК, всеки с приблизителна дължина от 20 двойки основи. Характеристиката на праймерите е такава, че те отговарят на участъци от ДНК, които трябва да се амплифицират, тоест на ДНК матрицата.
(Изображението е кликабельно) Кари Муллис, изобретател на ПЦР
Специфичността на ПЦР се основава на образуването на комплементарни комплекси между матрицата и праймерите – кратки синтетични олигонуклеотиди. Всеки от праймерите е комплементарен на една от веригите на двуверижната матрица и ограничава началото и края на амплифицируемата област. В действителност получената „матрица“ представлява цялостен геном и нашата цел е да изолираме от нея интересуващите ни фрагменти. За това двуверижната ДНК-матрица се нагрява до 95 °C за няколко минути, за да се разделят веригите на ДНК. Тази стъпка се нарича денатурация, тъй като се разрушават водородните връзки между двете вериги на ДНК. Когато веригите са разделени, температурата се понижава, за да могат праймерите да се свържат с едноверижната матрица. ДНК-полимеразата започва репликация на ДНК, като се свързва с участък от веригата на нуклеотидите. Ферментът ДНК-полимераза репликира матричната верига, използвайки праймера като стартов модел за копиране. В резултат на първия цикъл получаваме многократно последователно удвояване на определен участък от ДНК. След това повтаряме тази процедура. След всеки цикъл получаваме целевия участък в двойно количество. След двадесет и пет цикъла на ПЦР (т.е. за по-малко от два часа) имаме интересуващия ни участък ДНК в количество, 225 пъти превишаващо изходното (т.е. амплифицираме го около 34 милиона пъти). Всъщност, на входа получаваме смес от праймери, матрична ДНК, фермент ДНК-полимераза и свободни бази A, T, C и G. Количеството на специфичния продукт от реакцията (ограничен от праймерите) нараства експоненциално, докато количеството на „дългите“ копия на ДНК нараства линейно, поради което в продуктите от реакцията доминира специфичният продукт.
Амплификация на необходимия участък от ДНК: полимеразна верига реакция
В началото на използването на PCR основният проблем беше следният: след всеки цикъл на нагряване и охлаждане, беше необходимо да се добави ДНК полимераза в реакционната смес, тъй като тя се инактивираше при температура от 95 °C. Затова трябваше да я добавяме отново преди всеки от 25-те цикъла. Процедурата за провеждане на реакцията беше сравнително неефективна, изискваше много време и полимеразата не беше евтин материал. За щастие, на помощ дойде майка-природа. Много животни се чувстват комфортно при температури много над 37 °C. А защо числото 37 °C стана толкова важно за нас? Това стана, защото тази температура е оптимална за E. coli, от която произходно се извличаше полимеразата за PCR. В природата са намерени микроорганизми, чиито протеини след милиони години естествен отбор станаха по-устойчиви на действието на високи температури. Беше предложено да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и бяха в състояние да издържат на много цикли на реакцията. Използването им позволи да се опрости и автоматизира провеждането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази беше изолирана от бактерията Thermus aquaticus, обитаваща в горещите извори на националния парк Йелоустоун, и беше наречена Taq полимераза.
PCR бързо се превърна в основна работна конска сила на проекта "Човешкият геном". В общи линии, процесът не се отличава от разработения от Мълис, просто беше автоматизиран. Вече не зависехме от тълпа сляпи аспиранти, които внимателно преливаха капчици течност в пластмасови епруветки. В съвременните лаборатории, които извършват молекулярно-генетични изследвания, тази работа се извършва на роботизирани конвейери. PCR роботи, ангажирани в толкова мащабен проект за секвениране, като "Човешкият геном", невъзмутимо работят с огромни количества термоустойчива полимераза. Някои учени, работещи по проекта "Човешкият геном", бяха възмутени от неоправдано високите такси, добавяни към цената на консумативите от собственика на патента за PCR, европейския индустриален и фармацевтичен гигант Hoffmann-LaRoche.
Другият "движещ фактор" стана самият метод на секвениране на ДНК. Химичната основа на този метод по онова време вече не беше новост: Междудържавният проект "Човешки геном" (HGP) прие същия хитроумен метод, който още в средата на 70-те години на миналия век разработи Фред Сенгер. Иновацията тогава се състояла в мащаба и степента на автоматизация, които успяха да се постигнат при секвенирането.
Автоматичното секвениране първоначално беше разработвано в лабораторията на Ли Худ в Калифорнийския технологичен институт. Той завърши училище в щата Монтана и играеше американски футбол на позицията нападател; благодарение на Худ отборът неведнъж печелеше шампионата на щата. Уменията за работа в екип му послужиха и в научната му кариера. В лабораторията на Худ работеше разнообразна компания от химици, биолози и инженери, а скоро лабораторията му стана лидер в технологичните иновации.
Методът на автоматично секвениране всъщност е изобретен от Лойд Смит и Майк Хункапиллер. Майк Хункапиллер, който по онова време работел в лабораторията на Худ, се е обърнал към Лойд Смит с предложение за подобрен метод на секвениране, при който основите от всеки тип да бъдат оцветени в свой собствен цвят. Тази идея би могла да увеличи ефективността на метода на Сенгер четири пъти. При секвенирането на Сенгер в четирите пробирки (по броя на основите) с участието на ДНК полимераза се образува уникален набор от олигонуклеотиди с различна дължина, включващи праймерна последователност. След това в пробирките се добавя формамид за разделяне на веригите и се провежда електрофореза в полиакриламиден гел на четири отсечки. В подхода на Смит и Хункапиллер дидезоксинуклеотидите се маркират с четири различни оцветителя и PCR се извършва в една пробирка. След това, по време на електрофорезата в полиакриламидния гел, лазерен лъч в определено място в гела активира активността на оцветителите, а детекторът определя кой нуклеотид в момента мигрира през гела. Първоначално Смит беше настроен песимистично — той се опасяваше, че използването на свръхмалки дози оцветител ще доведе до неразличими нуклеотидни участъци. Въпреки това, познавайки отлично лазерните технологии, скоро намери решение, използвайки специални флуорохромни оцветители, които флуоресцират под действието на лазерно излъчване.
(Пълна версия — 4,08 МБ) С малък шрифт: последователността на ДНК, дешифрирана с помощта на автоматичен секвенатор, получена от уреда за автоматично секвениране. На всеки цвят отговаря една от четирите основи.
В класическия вариант на метода Сангър, една от веригите на анализираното ДНК служи като матрица за синтезиране на комплементарна верига от ензима ДНК полимераза. След това последователността на фрагментите ДНК се сортира в гел според размера. Всеки фрагмент, който е включен в състава на ДНК по време на синтеза и позволява впоследствие визуализация на продуктите на реакцията, се маркира с флуоресцентен оцветител, съответстващ на терминалната основа (както беше споменато на стр. 124); следователно, флуоресценцията на този фрагмент ще бъде идентификатор за дадената база. След това остава само да се извърши детекция и визуализация на продуктите на реакцията. Резултатите се анализират с помощта на компютър и се представят под формата на последователност от разноцветни върхове, съответстващи на четирите нуклеотида. След това информацията се предава директно в информационната система на компютъра, което изключва времево затратния и понякога мъчителен процес на въвеждане на данни, който значително затрудняваше секвенирането.
» По-подробно с книгата може да се запознаете на
»
»
За Хаброжителите отстъпка от 25% с ваучера — ПЦР
Източник: habr.com
