Почина Нобеловият лауреат Кари Мълис, изобретател на ДНК полимеразната верижна реакция

Американският нобелов лауреат по химия Кари Мълис почина в Калифорния на 74-годишна възраст. Според съпругата му смъртта е настъпила на 7 август. Причината е сърдечна и дихателна недостатъчност вследствие на пневмония.

Самият Джеймс Уотсън, откривателят на молекулата на ДНК, ще ни разкаже за приноса, който е направил в биохимията и за който е получил Нобелова награда.

Откъс от книгата на Джеймс Уотсън, Андрю Бери, Кевин Дейвис

ДНК. История на генетичната революция

Глава 7. Човешки геном. Житейски сценарий

...
Полимеразната верижна реакция (PCR) е изобретена през 1983 г. от биохимика Кери Мълис, който е работил в Cetus. Откриването на тази реакция беше доста забележително. По-късно Мълис си спомня: „Една петъчна вечер през април 1983 г. имах богоявление. Бях зад волана и карах по лунно осветен, криволичещ планински път в Северна Калифорния, страната на горите от секвоя.“ Прави впечатление, че точно в такава ситуация го осени вдъхновението. И не че Северна Калифорния има специални пътища, които насърчават прозрението; просто приятелят му веднъж видя Мълис да бърза безразсъдно по заледен път с две платна и това изобщо не го притесни. Един приятел каза на New York Times: „Мълис имаше видение, че ще умре, като се блъсна в секвоя. Затова той не се страхува от нищо, докато шофира, освен ако покрай пътя не растат секвои.” Наличието на секвои покрай пътя принуди Мълис да се концентрира и... ето го, прозрение. Мълис получава Нобелова награда за химия за изобретението си през 1993 г. и оттогава е станал още по-странен в действията си. Например, той е привърженик на ревизионистката теория, че СПИН не е свързан с ХИВ, което значително подкопава собствената му репутация и пречи на лекарите.

PCR е доста проста реакция. За да го осъществим, имаме нужда от два химически синтезирани праймера, които са комплементарни на противоположните краища на различни вериги на необходимия ДНК фрагмент. Праймерите са къси участъци от едноверижна ДНК, всяка с дължина около 20 базови двойки. Особеността на праймерите е, че те съответстват на ДНК участъците, които трябва да бъдат амплифицирани, тоест ДНК шаблона.

(Изображението може да се кликне) Кари Мулис, изобретател на PCR

Специфичността на PCR се основава на образуването на комплементарни комплекси между матрицата и праймерите, къси синтетични олигонуклеотиди. Всеки праймер е комплементарен към една от нишките на двойноверижния шаблон и ограничава началото и края на амплифицираната област. Всъщност получената „матрица“ е цял геном и нашата цел е да изолираме от него фрагментите, които ни интересуват. За да направите това, двуверижната ДНК матрица се нагрява до 95 °C за няколко минути, за да се разделят ДНК веригите. Този етап се нарича денатурация, тъй като водородните връзки между двете ДНК вериги се разкъсват. След като нишките се разделят, температурата се понижава, за да позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. ДНК полимеразата започва репликация на ДНК чрез свързване към участък от нуклеотидна верига. Ензимът ДНК полимераза репликира шаблонната верига, използвайки праймер като праймер или пример за копиране. В резултат на първия цикъл получаваме многократно последователно удвояване на определен участък от ДНК. След това повтаряме тази процедура. След всеки цикъл получаваме целева зона в двойно количество. След двадесет и пет PCR цикъла (т.е. за по-малко от два часа) имаме интересуващата ни ДНК област в количество 225 пъти по-високо от оригинала (т.е. ние сме я амплифицирали приблизително 34 милиона пъти). Всъщност на входа получихме смес от праймери, матрична ДНК, ензим ДНК полимераза и свободни бази A, C, G и T, количеството на специфичен реакционен продукт (ограничен от праймери) нараства експоненциално и броят на “ дълги” ДНК копия е линеен, така че реакционните продукти доминират.

Амплификация на желаната ДНК секция: полимеразна верижна реакция

В ранните дни на PCR основният проблем беше следният: след всеки цикъл на нагряване-охлаждане към реакционната смес трябваше да се добави ДНК полимераза, тъй като тя беше инактивирана при температура от 95 ° C. Следователно беше необходимо да се добавя отново преди всеки от 25-те цикъла. Реакционната процедура беше относително неефективна, изискваше много време и ензим полимераза, а материалът беше много скъп. За щастие майката природа се притекла на помощ. Много животни се чувстват комфортно при температури много по-високи от 37 °C. Защо цифрата 37 °C стана важна за нас? Това се случи, защото тази температура е оптимална за E. coli, от която първоначално е получен ензимът полимераза за PCR. В природата има микроорганизми, чиито протеини, в продължение на милиони години естествен подбор, са станали по-устойчиви на високи температури. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и успяха да издържат на много реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерията Thermus aquaticus, която живее в горещите извори на националния парк Йелоустоун, и е наречена Taq полимераза.

PCR бързо се превърна в работния кон на проекта за човешкия геном. Като цяло процесът не се различава от този, разработен от Mullis, просто е автоматизиран. Вече не бяхме зависими от тълпа малоумни студенти, старателно наливащи капчици течност в пластмасови епруветки. В съвременните лаборатории, извършващи молекулярно-генетични изследвания, тази работа се извършва на роботизирани конвейери. PCR роботите, участващи в проект за секвениране, голям като човешкия геном, работят безмилостно с огромни обеми топлоустойчива полимераза. Някои учени, работещи по проекта за човешкия геном, бяха възмутени от неоправдано високите хонорари, добавени към цената на консумативите от собственика на PCR патента, европейския индустриален фармацевтичен гигант Hoffmann-LaRoche.

Друг „движещ принцип“ беше самият метод за секвениране на ДНК. Химическата основа на този метод вече не е нова по това време: Междущатският проект за човешкия геном (HGP) възприема същия гениален метод, който Фред Сангер е разработил още в средата на 1970-те години. Иновацията се крие в мащаба и степента на автоматизация, които секвенирането успя да постигне.

Автоматизираното секвениране първоначално е разработено в лабораторията на Лий Худ в Калифорнийския технологичен институт. Той посещава гимназия в Монтана и играе колежански футбол като защитник; Благодарение на Худ отборът спечели държавното първенство повече от веднъж. Неговите умения за работа в екип също са били полезни в научната му кариера. Лабораторията на Худ беше обслужвана от пъстър екип от химици, биолози и инженери и неговата лаборатория скоро стана лидер в технологичните иновации.

Всъщност методът за автоматизирано секвениране е изобретен от Лойд Смит и Майк Хункапилър. Майк Хънкапилър, работещ тогава в лабораторията на Худ, се обръща към Лойд Смит с предложение за подобрен метод за секвениране, при който всеки тип основа ще бъде оцветен по различен начин. Подобна идея може да учетвори ефективността на процеса Sanger. При Sanger при секвениране във всяка от четирите епруветки (според броя на базите) с участието на ДНК полимераза се образува уникален набор от олигонуклеотиди с различна дължина, включително праймерна последователност. След това се добавя формамид към епруветките за разделяне на веригата и се извършва електрофореза с полиакриламиден гел на четири ленти. Във версията на Smith и Hunkapiller дидезоксинуклеотидите се маркират с четири различни багрила и PCR се извършва в една епруветка. След това, по време на електрофореза с полиакриламиден гел, лазерен лъч на определено място върху гела възбужда активността на багрилата и детекторът определя кой нуклеотид в момента мигрира през гела. Първоначално Смит беше песимист - той се страхуваше, че използването на ултра ниски дози багрило ще доведе до неразличимост на нуклеотидните области. Въпреки това, имайки отлично разбиране на лазерната технология, той скоро намери изход от ситуацията, като използва специални флуорохромни багрила, които флуоресцират, когато са изложени на лазерно лъчение.

(Пълна версия чрез щракване - 4,08 MB) Дребен шрифт: секвенция на ДНК, секвенирана с помощта на автоматичен секвенатор, получена от машина за автоматично секвениране. Всеки цвят съответства на една от четирите бази

В класическата версия на метода Sanger, една от веригите на анализираната ДНК действа като матрица за синтеза на комплементарна верига от ензима ДНК полимераза, след което последователността от ДНК фрагменти се сортира в гел по размер. Всеки фрагмент, който е включен в ДНК по време на синтеза и позволява последваща визуализация на реакционните продукти, е маркиран с флуоресцентно багрило, съответстващо на крайната база (това беше обсъдено на стр. 124); следователно, флуоресценцията на този фрагмент ще бъде идентификатор за дадена база. След това остава само да се извърши детекция и да се визуализират продуктите на реакцията. Резултатите се анализират от компютър и се представят като последователност от многоцветни пикове, съответстващи на четири нуклеотида. След това информацията се прехвърля директно към информационната система на компютъра, елиминирайки отнемащия време и понякога болезнен процес на въвеждане на данни, който прави последователността много трудна.

» За повече информация относно книгата, моля посетете уебсайт на издателя
» Таблица на съдържанието
» Откъс

За Khabrozhiteli 25% отстъпка от купона - PCR

Източник: www.habr.com