Američka nobelovka za hemiju Kary Mullis umrla je u Kaliforniji u 74. godini. Prema riječima njegove supruge, smrt se dogodila 7. avgusta. Uzrok je srčana i respiratorna insuficijencija zbog upale pluća.
O svom doprinosu biohemiji i za koji je dobio Nobelovu nagradu, ispričat će nam sam James Watson, otkrivač molekule DNK.
Odlomak iz knjige James Watsona, Andrew Berry, Kevin Davis
DNK. Istorija genetske revolucije
Poglavlje 7. Ljudski genom. Životni scenario
...
Lančanu reakciju polimeraze (PCR) izumio je 1983. biohemičar Carey Mullis, koji je radio u Cetusu. Otkriće ove reakcije bilo je prilično izvanredno. Mullis se kasnije prisjetio: „Jednog petka uveče u aprilu 1983. imao sam bogojavljenje. Bio sam za volanom, vozeći se mjesečinom obasjanim, krivudavim planinskim putem u sjevernoj Kaliforniji, zemlji šuma sekvoje.” Impresivno je da ga je upravo u takvoj situaciji snašla inspiracija. I nije da sjeverna Kalifornija ima posebne puteve koji promovišu uvid; samo što je njegov prijatelj jednom vidio Mullisa kako bezobzirno juri po zaleđenom dvojnom kolovozu i to mu nimalo nije smetalo. Prijatelj je rekao za New York Times: „Mullis je imao viziju da će umrijeti udarivši u drvo sekvoje. Dakle, on se ničega ne plaši dok vozi, osim ako pored puta ne raste drveće sekvoja.” Prisustvo sekvoje duž ceste natjeralo je Mullisa da se koncentriše i... evo ga, uvid. Mullis je dobio Nobelovu nagradu za hemiju za svoj izum 1993. godine i od tada je postao još čudniji u svojim postupcima. Na primjer, on je pristalica revizionističke teorije da SIDA nije povezana s HIV-om, što je značajno narušilo njegovu vlastitu reputaciju i ometalo rad doktora.
PCR je prilično jednostavna reakcija. Da bismo to izveli, potrebna su nam dva kemijski sintetizirana prajmera koja su komplementarna suprotnim krajevima različitih lanaca potrebnog DNK fragmenta. Prajmeri su kratki delovi jednolančane DNK, svaki dužine oko 20 parova baza. Posebnost prajmera je u tome što odgovaraju dijelovima DNK koje treba pojačati, odnosno DNK šablonu.
(Kliknuti na sliku) Kary Mullis, izumitelj PCR-a
Specifičnost PCR-a zasniva se na formiranju komplementarnih kompleksa između šablona i prajmera, kratkih sintetičkih oligonukleotida. Svaki od prajmera je komplementaran jednom od lanaca dvolančanog šablona i ograničava početak i kraj amplificiranog regiona. U stvari, rezultirajuća "matrica" je cijeli genom, a naš cilj je da iz njega izolujemo fragmente koji nas zanimaju. Da bi se to učinilo, dvolančani DNK šablon se zagrijava na 95 °C nekoliko minuta kako bi se odvojili DNK lanci. Ova faza se naziva denaturacija jer su vodonične veze između dva lanca DNK prekinute. Kada se lanci razdvoje, temperatura se snižava kako bi se prajmerima omogućilo da se vežu za jednolančani šablon. DNK polimeraza započinje replikaciju DNK vezivanjem za dio nukleotidnog lanca. Enzim DNK polimeraza replicira lanac šablona koristeći prajmer kao prajmer ili primjer za kopiranje. Kao rezultat prvog ciklusa, dobijamo višestruko uzastopno udvostručavanje određenog dijela DNK. Zatim ponavljamo ovaj postupak. Nakon svakog ciklusa dobijamo ciljno područje u dvostrukoj količini. Nakon dvadeset pet PCR ciklusa (tj. za manje od dva sata), imamo DNK regiju koja nas zanima u količini 225 puta većoj od originalne (odnosno, pojačali smo je približno 34 miliona puta). Zapravo, na ulazu smo dobili mješavinu prajmera, šablonske DNK, enzima DNK polimeraze i slobodnih baza A, C, G i T, količina specifičnog produkta reakcije (ograničenog prajmerima) eksponencijalno raste, a broj “dugih” kopija DNK je linearan, tako da u produktima reakcije dominira.
Amplifikacija željenog dijela DNK: lančana reakcija polimeraze
U prvim danima PCR-a glavni problem je bio sljedeći: nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcionu smjesu je morala biti dodavana DNK polimeraza, jer je bila inaktivirana na temperaturi od 95 °C. Stoga ga je bilo potrebno ponovo dodati prije svakog od 25 ciklusa. Reakciona procedura je bila relativno neefikasna, zahtevala je dosta vremena i enzima polimeraze, a materijal je bio veoma skup. Srećom, majka priroda je priskočila u pomoć. Mnoge životinje se osjećaju ugodno na temperaturama mnogo višim od 37 °C. Zašto nam je cifra 37 °C postala važna? To se dogodilo jer je ova temperatura optimalna za E. coli, iz koje je prvobitno dobijen enzim polimeraze za PCR. U prirodi postoje mikroorganizmi čiji su proteini, tokom miliona godina prirodne selekcije, postali otporniji na visoke temperature. Predloženo je korištenje DNK polimeraza iz termofilnih bakterija. Pokazalo se da su ovi enzimi termostabilni i mogli su izdržati mnoge reakcione cikluse. Njihova upotreba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNK polimeraza izolirana je iz bakterije Thermus aquaticus, koja živi u toplim izvorima Nacionalnog parka Yellowstone, i nazvana je Taq polimeraza.
PCR je brzo postao radni konj projekta Ljudski genom. Općenito, proces se ne razlikuje od onog koji je razvio Mullis, upravo je automatiziran. Više nismo zavisili od gomile glupih diplomiranih studenata koji su mukotrpno sipali kapljice tečnosti u plastične epruvete. U modernim laboratorijama u kojima se izvode molekularna genetička istraživanja, ovaj posao se obavlja na robotskim transporterima. PCR roboti uključeni u projekat sekvenciranja koji je velik poput ljudskog genoma nemilosrdno rade s ogromnim količinama polimeraze stabilne na toplinu. Neki naučnici koji rade na projektu Ljudski genom bili su ogorčeni zbog nerazumno visokih honorara koje je vlasnik PCR patenta, evropski industrijski farmaceutski gigant Hoffmann-LaRoche, dodao na troškove potrošnog materijala.
Još jedan "pokretački princip" bio je sama metoda sekvenciranja DNK. Hemijska osnova ove metode u to vrijeme više nije bila nova: Međudržavni projekat ljudskog genoma (HGP) usvojio je isti genijalni metod koji je Fred Sanger razvio sredinom 1970-ih. Inovacija je bila u skali i stepenu automatizacije koju je sekvenciranje bilo u stanju da postigne.
Automatsko sekvenciranje je prvobitno razvijeno u laboratoriju Lee Hooda na Kalifornijskom institutu za tehnologiju. Pohađao je srednju školu u Montani i igrao koledž fudbal kao bek; Zahvaljujući Hoodu, tim je više puta osvojio državno prvenstvo. Njegove vještine timskog rada također su mu dobro došle u naučnoj karijeri. U Hoodovoj laboratoriji radila je šarolika ekipa hemičara, biologa i inženjera, a njegova laboratorija je ubrzo postala lider u tehnološkim inovacijama.
U stvari, automatizovanu metodu sekvenciranja izmislili su Lloyd Smith i Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, koji je tada radio u Hoodovoj laboratoriji, obratio se Lloydu Smithu s prijedlogom za poboljšanu metodu sekvenciranja u kojoj bi svaka vrsta baze bila drugačije obojena. Takva ideja mogla bi učetvorostručiti efikasnost Sangerovog procesa. Kod Sangera, pri sekvenciranju u svakoj od četiri epruvete (prema broju baza), uz sudjelovanje DNK polimeraze, formira se jedinstveni skup oligonukleotida različite dužine, uključujući sekvencu prajmera. Zatim je u epruvete dodat formamid za razdvajanje lanca i elektroforeza u poliakrilamidnom gelu je izvedena na četiri trake. U Smith i Hunkapillerovoj verziji, dideoksinukleotidi su označeni sa četiri različite boje i PCR se izvodi u jednoj epruveti. Zatim, tokom elektroforeze u poliakrilamidnom gelu, laserski snop na određenoj lokaciji na gelu pobuđuje aktivnost boja, a detektor određuje koji nukleotid trenutno migrira kroz gel. Smit je isprva bio pesimističan – bojao se da će korišćenje ultraniskih doza boje dovesti do toga da se nukleotidni regioni ne mogu razlikovati. Međutim, odlično poznavajući lasersku tehnologiju, ubrzo je pronašao izlaz iz situacije koristeći posebne fluorohromne boje koje fluoresciraju kada su izložene laserskom zračenju.
(Puna verzija - 4,08 MB) Fini ispis: sekvencija DNK sekvencionirana pomoću automatskog sekvencera, dobijenog iz automatske mašine za sekvenciranje. Svaka boja odgovara jednoj od četiri baze
U klasičnoj verziji Sangerove metode, jedan od lanaca analizirane DNK djeluje kao šablon za sintezu komplementarnog lanca enzimom DNK polimerazom, zatim se sekvenca fragmenata DNK sortira u gelu po veličini. Svaki fragment, koji je uključen u DNK tokom sinteze i omogućava naknadnu vizualizaciju produkta reakcije, obeležen je fluorescentnom bojom koja odgovara terminalnoj bazi (o tome je bilo reči na str. 124); stoga će fluorescencija ovog fragmenta biti identifikator za datu bazu. Zatim ostaje samo da se izvrši detekcija i vizualiziraju produkti reakcije. Rezultati su kompjuterski analizirani i predstavljeni kao niz višebojnih pikova koji odgovaraju četiri nukleotida. Informacije se zatim prenose direktno u informacioni sistem računara, eliminišući dugotrajan i ponekad bolan proces unosa podataka koji je otežavao sekvenciranje.
» Za više informacija o knjizi, posjetite
»
»
Za Khabrozhiteli 25% popusta na kupon - PCR
izvor: www.habr.com