Ang American Nobel laureate sa chemistry nga si Kary Mullis namatay sa California sa edad nga 74. Sumala sa iyang asawa, ang kamatayon nahitabo niadtong Agosto 7. Ang hinungdan mao ang pagkapakyas sa kasingkasing ug respiratoryo tungod sa pneumonia.
Si James Watson mismo, ang nakadiskobre sa molekula sa DNA, mosulti kanato mahitungod sa iyang kontribusyon sa biochemistry ug diin siya nakadawat sa Nobel Prize.
Kinutlo gikan sa libro ni James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Kasaysayan sa Genetic Revolution
Kapitulo 7. Human genome. Sinaryo sa kinabuhi
...
Ang polymerase chain reaction (PCR) naimbento niadtong 1983 sa biochemist nga si Carey Mullis, nga nagtrabaho sa Cetus. Ang pagkadiskobre niini nga reaksyon talagsaon kaayo. Sa ulahi nahinumdom si Mullis: βUsa ka Biyernes sa gabii sa Abril 1983, ako adunay epipanya. Ako diha sa luyo sa ligid, nagdrayb subay sa kahayag sa bulan, naglikoliko nga dalan sa bukid sa Amihanang California, ang yuta sa redwood nga kalasangan.β Makapahingangha nga naa sa ingon nga kahimtang nga ang inspirasyon miigo kaniya. Ug dili nga ang amihanang California adunay espesyal nga mga dalan nga nagpasiugda sa panabut; mao lang nga ang iyang higala kausa nakakita sa Mullis nga paspas nga nagdagan subay sa usa ka yelo nga dual carriageway ug wala gyud kini makahasol kaniya. Usa ka higala misulti sa New York Times: "Si Mullis adunay usa ka panan-awon nga siya mamatay pinaagi sa pagkabangga sa usa ka redwood nga kahoy. Busa, wala siya mahadlok bisan unsa samtang nagdrayb, gawas kung adunay mga kahoy nga redwood nga nagtubo sa daplin sa dalan. Ang presensya sa mga redwood sa daplin sa dalan nagpugos sa Mullis sa pag-concentrate ug ... ania kini, usa ka panabut. Si Mullis nakadawat sa Nobel Prize sa Chemistry alang sa iyang imbensyon niadtong 1993 ug sukad niadto nahimong estranghero sa iyang mga aksyon. Pananglitan, usa siya ka tigpaluyo sa rebisyonistang teorya nga ang AIDS walay kalabotan sa HIV, nga nakadaot pag-ayo sa iyang kaugalingong dungog ug nakabalda sa mga doktor.
Ang PCR usa ka yano nga reaksyon. Aron mahimo kini, kinahanglan nato ang duha ka chemically synthesized primers nga komplementaryo sa magkaatbang nga tumoy sa lain-laing mga strand sa gikinahanglan nga DNA fragment. Ang mga primer maoy mugbong mga seksyon sa single-stranded nga DNA, ang matag usa mga 20 ka baseng pares ang gitas-on. Ang peculiarity sa mga primer mao nga sila katumbas sa mga seksyon sa DNA nga kinahanglan nga mapadako, nga mao, ang template sa DNA.
(Image clickable) Kary Mullis, imbentor sa PCR
Ang espesipiko sa PCR gibase sa pagporma sa mga complementary complexes tali sa template ug primers, mubo nga sintetikong oligonucleotides. Ang matag primer komplementaryo sa usa sa mga strand sa double-stranded template ug gilimitahan ang sinugdanan ug katapusan sa gipadako nga rehiyon. Sa tinuud, ang sangputanan nga "matrix" usa ka tibuuk nga genome, ug ang among katuyoan mao ang pagbulag sa mga tipik sa interes kanamo gikan niini. Aron mahimo kini, ang double-stranded DNA template gipainit sa 95 Β°C sulod sa pipila ka minuto aron mabulag ang DNA strands. Kini nga yugto gitawag ug denaturation tungod kay ang hydrogen bonds tali sa duha ka DNA strand naputol. Sa diha nga ang mga strand nagbulag, ang temperatura ipaubos aron ang mga primero makabugkos sa single-stranded template. Ang DNA polymerase nagsugod sa pagkopya sa DNA pinaagi sa pagbugkos sa usa ka bahin sa kadena sa nucleotide. Ang enzyme nga DNA polymerase nagkopya sa template strand gamit ang primer isip primer o pananglitan sa pagkopya. Ingon usa ka sangputanan sa una nga siklo, nakakuha kami daghang sunud-sunod nga pagdoble sa usa ka seksyon sa DNA. Sunod atong balikon kini nga pamaagi. Human sa matag siklo kita makakuha og usa ka target nga dapit sa doble nga gidaghanon. Human sa kawhaan ug lima ka mga siklo sa PCR (nga mao, sa wala pay duha ka oras), aduna na kitay interes nga rehiyon sa DNA sa kantidad nga 225 ka pilo nga mas taas kay sa orihinal (sa ato pa, gipadako nato kini sa gibana-bana nga 34 ka milyon ka beses). Sa tinuud, sa input nakadawat kami usa ka sinagol nga mga primer, template nga DNA, ang DNA polymerase enzyme ug libre nga mga base A, C, G ug T, ang kantidad sa usa ka piho nga produkto sa reaksyon (limitado sa mga primer) motubo nga paspas, ug ang gidaghanon sa "taas" nga mga kopya sa DNA linear, mao nga sa reaksyon ang mga produkto nagdominar.
Pagpadako sa gitinguha nga seksyon sa DNA: polymerase chain reaction
Sa unang mga adlaw sa PCR, ang nag-unang problema mao ang mosunod: human sa matag heating-cooling cycle, ang DNA polymerase kinahanglan idugang sa reaksyon nga sagol, tungod kay kini dili aktibo sa temperatura nga 95 Β° C. Busa, kinahanglan nga idugang kini pag-usab sa wala pa ang matag usa sa 25 nga mga siklo. Ang pamaagi sa reaksyon medyo dili epektibo, nanginahanglan daghang oras ug ang polymerase enzyme, ug ang materyal mahal kaayo. Suwerte, ang Inahan nga Kinaiyahan mitabang. Daghang mga hayop ang mobati nga komportable sa temperatura nga labi ka taas sa 37 Β°C. Ngano nga ang numero nga 37 Β°C nahimong importante alang kanato? Nahitabo kini tungod kay kini nga temperatura labing maayo alang sa E. coli, diin ang polymerase enzyme alang sa PCR orihinal nga nakuha. Sa kinaiyahan adunay mga microorganism kansang mga protina, sa minilyon ka tuig nga natural selection, nahimong mas makasugakod sa taas nga temperatura. Gisugyot nga gamiton ang DNA polymerases gikan sa thermophilic bacteria. Kini nga mga enzyme nahimo nga thermostable ug nakahimo sa pag-agwanta sa daghang mga siklo sa reaksyon. Ang ilang paggamit nagpaposible sa pagpayano ug pag-automate sa PCR. Usa sa unang thermostable nga DNA polymerases gilain gikan sa bakterya nga Thermus aquaticus, nga nagpuyo sa init nga mga tubod sa Yellowstone National Park, ug ginganlan og Taq polymerase.
Ang PCR dali nga nahimong workhorse sa Human Genome Project. Sa kinatibuk-an, ang proseso wala'y kalainan sa usa nga naugmad ni Mullis, bag-o lang kini nga awtomatiko. Wala na kami nagsalig sa panon sa mga buta nga gradwado nga mga estudyante nga makugihong nagbubo sa mga tinulo sa likido sa mga plastik nga tubo sa pagsulay. Sa modernong mga laboratoryo nga nagpahigayon sa panukiduki sa genetic nga molekula, kini nga trabaho gihimo sa mga robotic conveyor. Ang mga PCR robot nga nalambigit sa usa ka sequencing nga proyekto sama ka dako sa Human Genome nga walay hunong nga nagtrabaho uban sa dagkong mga volume sa heat-stable polymerase. Ang ubang mga siyentista nga nagtrabaho sa Human Genome Project nasuko sa dili makatarunganon nga taas nga royalties nga gidugang sa gasto sa mga magamit sa tag-iya sa PCR patent, ang higanteng industriyal nga parmasyutiko sa Europa nga si Hoffmann-LaRoche.
Ang laing "prinsipyo sa pagmaneho" mao ang pamaagi sa pagsunud sa DNA mismo. Ang kemikal nga basehanan niini nga pamaagi dili na bag-o niadtong panahona: ang Interstate Human Genome Project (HGP) nagsagop sa samang mamugnaong pamaagi nga gihimo ni Fred Sanger balik sa tunga-tunga sa 1970s. Ang kabag-ohan naa sa sukod ug ang-ang sa automation nga nahimo sa pagkasunod-sunod.
Ang automated sequencing orihinal nga naugmad sa Lee Hood's laboratoryo sa California Institute of Technology. Nag-eskwela siya sa high school sa Montana ug nagdula sa football sa kolehiyo isip quarterback; Salamat sa Hood, ang koponan nakadaog sa kampeonato sa estado labaw sa usa ka beses. Ang iyang kahanas sa pagtinabangay magamit usab sa iyang karera sa siyensya. Ang laboratoryo ni Hood adunay kawani sa usa ka motley nga tripulante sa mga chemist, biologist, ug mga inhenyero, ug ang iyang laboratoryo sa wala madugay nahimong usa ka lider sa kabag-ohan sa teknolohiya.
Sa pagkatinuod, ang automated sequencing nga pamaagi giimbento ni Lloyd Smith ug Mike Hunapilller. Si Mike Hunkapiller, nga nagtrabaho kaniadto sa laboratoryo ni Hood, miduol kang Lloyd Smith uban ang usa ka sugyot alang sa usa ka gipaayo nga pamaagi sa pagsunud diin ang matag klase sa base adunay lainlain nga kolor. Ang ingon nga ideya mahimoβg mapilo ang kaepektibo sa proseso sa Sanger. Sa Sanger, kung ang pagsunud sa matag usa sa upat ka mga tubo (sumala sa gidaghanon sa mga base), nga adunay pag-apil sa DNA polymerase, usa ka talagsaon nga hugpong sa mga oligonucleotides nga lainlain ang gitas-on ang naporma, lakip ang usa ka primer nga han-ay. Sunod, ang formamide gidugang sa mga tubo alang sa pagbulag sa kadena ug ang polyacrylamide gel electrophoresis gihimo sa upat ka mga lane. Sa bersyon ni Smith ug Hunkapiller, ang dideoxynucleotides gimarkahan og upat ka lain-laing mga tina ug ang PCR gihimo sa usa ka tubo. Unya, sa panahon sa polyacrylamide gel electrophoresis, ang usa ka laser beam sa usa ka piho nga lokasyon sa gel naghinam-hinam sa kalihokan sa mga tina, ug ang detector nagtino kung unsang nucleotide ang karon migrate pinaagi sa gel. Sa sinugdan, si Smith pessimistic - nahadlok siya nga ang paggamit sa ultra-ubos nga dosis sa tina mahimong mosangpot sa mga rehiyon sa nucleotide nga dili mailhan. Bisan pa, nga adunay maayo kaayo nga pagsabut sa teknolohiya sa laser, sa wala madugay nakit-an niya ang usa ka paagi sa paggawas sa sitwasyon pinaagi sa paggamit sa espesyal nga mga tina nga fluorochrome nga nag-fluoresce kung na-expose sa radiation sa laser.
(Bug-os nga bersyon - 4,08 MB) Maayo nga pag-imprinta: Ang pagkasunod-sunod sa DNA nga gisunod gamit ang usa ka awtomatik nga sequencer, nakuha gikan sa usa ka awtomatikong pagsunud nga makina. Ang matag kolor katumbas sa usa sa upat ka base
Sa klasiko nga bersyon sa pamaagi sa Sanger, ang usa sa mga strand sa na-analisa nga DNA naglihok ingon usa ka template alang sa synthesis sa usa ka komplementaryong strand sa enzyme DNA polymerase, unya ang pagkasunod-sunod sa mga tipik sa DNA gisunud sa usa ka gel sa gidak-on. Ang matag tipik nga gilakip sa DNA sa panahon sa synthesis ug nagtugot sa sunod nga pagtan-aw sa mga produkto sa reaksyon gimarkahan sa usa ka fluorescent nga tina nga katumbas sa terminal base (kini gihisgutan sa p. 124); busa, ang fluorescence niini nga tipik mahimong usa ka identifier alang sa gihatag nga base. Pagkahuman ang nahabilin mao ang paghimo sa pagtuki ug paghanduraw sa mga produkto sa reaksyon. Ang mga resulta gi-analisa sa kompyuter ug gipresentar isip usa ka han-ay sa multi-colored nga mga taluktok nga katumbas sa upat ka mga nucleotides. Ang impormasyon dayon ibalhin direkta ngadto sa sistema sa impormasyon sa kompyuter, nga mawagtang ang makahurot sa panahon ug usahay masakit nga proseso sa pagsulod sa datos nga nakapalisod sa pagkasunodsunod.
Β» Para sa dugang nga impormasyon bahin sa libro, palihog bisitaha
Β»
Β»
Alang sa Khabrozhiteli 25% nga diskwento sa kupon - PCR
Source: www.habr.com