U premiu Nobel americanu in chimica Kary Mullis hè mortu in California à l'età di 74 anni. Sicondu a so moglia, a morte hè accaduta u 7 d'aostu. A causa hè fallimentu cardiacu è respiratorju per a pneumonia.
Ghjacumu Watson stessu, u scupertore di a molècula di DNA, ci cuntarà di a so cuntribuzione à a biochimica è per a quale hà ricevutu u Premiu Nobel.
Estratto da u libru di James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Storia di a Rivuluzione Genetica
Capitulu 7. Genomu umanu. Scenariu di vita
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A reazione in catena di polimerasi (PCR) hè stata inventata in u 1983 da u biochimistu Carey Mullis, chì hà travagliatu in Cetus. A scuperta di sta reazzione hè stata assai notevuli. Mullis hà ricurdatu dopu: "Un vennari sera d'aprile 1983, aghju avutu una epifania. Eru à u volante, guidandu per una strada di muntagna sinuosa è illuminata di luna in u Nordu di a California, a terra di e fureste di sequoia. Hè impressiunanti chì era in una tale situazione chì l'ispirazione l'hà colpitu. È ùn hè micca chì u Californiu sittintriunali hà strade spiciali chì prumove insight; hè solu chì u so amicu hà vistu una volta Mullis chì correva in modu imprudente nantu à una strada ghiacciata è ùn l'hà micca disturbatu per tuttu. Un amicu hà dettu à u New York Times: "Mullis hà avutu una visione ch'ellu moriria sbattendu in un arbulu di sequoia. Dunque, ùn hà micca paura di nunda mentre conduce, salvu chì ci sò arburi di sequoia chì crescenu longu a strada ". A prisenza di sequoie longu à a strada hà custrettu Mullis à cuncentrazione è... eccu, un insight. Mullis hà ricevutu u Premiu Nobel in Chimica per a so invenzione in u 1993 è hè diventatu ancu più stranu in i so azzioni. Per esempiu, hè un sustegnu di a teoria revisionista chì l'AIDS ùn hè micca ligata à l'HIV, chì hà minatu significativamente a so propria reputazione è interferiscenu cù i medichi.
A PCR hè una reazione abbastanza simplice. Per eseguisce, avemu bisognu di dui primers sintetizzati chimicamente chì sò cumplementarii à l'estremità opposte di diversi filamenti di u fragmentu di DNA necessariu. I primers sò brevi sezioni di DNA monocatena, ciascuna di circa 20 coppie di basi in lunghezza. A peculiarità di i primers hè chì currispondenu à e rùbbriche di DNA chì deve esse amplificatu, vale à dì, u mudellu di DNA.
(Image clickable) Kary Mullis, inventore di PCR
A specificità di a PCR hè basatu annantu à a furmazione di cumplementari cumplementari trà u mudellu è i primi, oligonucleotidi sintetici brevi. Ogni primer hè cumplementarii à unu di i filamenti di u mudellu di doppia fila è limita u principiu è a fine di a regione amplificata. In fatti, a "matrice" risultante hè un genoma sanu, è u nostru scopu hè di isolà i frammenti di interessu per noi da ellu. Per fà questu, u mudellu di DNA à doppia fila hè riscaldatu à 95 ° C per parechji minuti per separà i filamenti di DNA. Questa tappa hè chjamata denaturazione perchè i ligami di l'idrogenu trà i dui filamenti di DNA sò rotti. Una volta chì i filamenti si sò separati, a temperatura hè abbassata per permette à i primeri di ligà à u mudellu unicu filatu. L'ADN polimerasi principia a replicazione di l'ADN liendu à un trattu di catena di nucleotidi. L'enzima DNA polimerasi replica u filamentu di u mudellu utilizendu un primer cum'è primer o esempiu per a copia. In u risultatu di u primu ciculu, ottenemu multiplici di duplicazione sequenziale di una certa sezione di DNA. Dopu avemu ripetutu sta prucedura. Dopu ogni ciculu, ottene una zona di destinazione in quantità doppia. Dopu vinticinque cicli di PCR (vale à dì, in menu di duie ore), avemu a regione di DNA chì ci interessa in una quantità 225 volte più altu ch'è l'uriginale (vale à dì, avemu amplificatu circa 34 milioni di volte). In fattu, à l'input avemu ricevutu una mistura di primers, DNA template, l'enzima DNA polimerasi è basi liberi A, C, G è T, a quantità di un pruduttu di reazione specificu (limitatu da i primers) cresce in modu esponenziale, è u numeru. di copie di DNA "longu" hè lineare, cusì in i prudutti di reazione domina.
Amplificazione di a sezione di DNA desiderata: reazione in catena di polimerasi
In i primi tempi di a PCR, u prublema principali era u seguente: dopu à ogni ciculu di riscaldamentu-raffreddamentu, l'ADN polimerasi deve esse aghjuntu à a mistura di reazzione, postu chì hè stata inattivata à una temperatura di 95 ° C. Per quessa, era necessariu di re-aghjunghje prima di ognunu di i ciculi 25. A prucedura di reazzione era relativamente inefficient, necessitava assai tempu è l'enzima polimerasi, è u materiale era assai caru. Per furtuna, a Mamma Natura hè ghjunta in salvezza. Parechji animali si sentenu cunfortu à a temperatura assai più altu di 37 ° C. Perchè a figura 37 °C hè diventata impurtante per noi ? Questu hè accadutu perchè sta temperatura hè ottima per E. coli, da quale l'enzima polimerasi per a PCR hè stata urigginata. In a natura ci sò microrganismi chì e proteine , annantu à milioni di anni di selezzione naturali, sò diventate più resistenti à e alte temperature. Hè statu prupostu di utilizà DNA polimerasi da i batteri termofili. Questi enzimi sò diventati termostabili è sò stati capaci di sustene parechji cicli di reazzione. U so usu hà permessu di simplificà è automatizà a PCR. Una di e prime DNA polimerasi termostabili hè stata isolata da u bacteriu Thermus aquaticus, chì vive in e surgenti termali di u Parcu Naziunale di Yellowstone, è fù chjamatu Taq polymerase.
A PCR diventò rapidamente u cavallu di travagliu di u Prughjettu Genoma Umanu. In generale, u prucessu ùn hè micca sfarente di quellu sviluppatu da Mullis, hè statu solu automatizatu. Ùn eramu più dipendente da una folla di studenti graduati disgraziati chì versanu diligentemente gocce di liquidu in provette di plastica. In i laboratorii muderni chì realizanu a ricerca genetica moleculare, stu travagliu hè realizatu nantu à trasportatori robotichi. I robot di PCR implicati in un prughjettu di sequenza quant'è u Genoma Umanu travaglianu senza tregua cù volumi enormi di polimerasi termostabile. Certi scientisti chì travaglianu in u Prughjettu Genoma Umanu eranu indignati da i royalties irragionevolmente elevati aghjuntu à u costu di i consumabili da u pruprietariu di a patente PCR, u giant farmaceuticu industriale europeu Hoffmann-LaRoche.
Un altru "principiu di guida" era u metudu di sequencing DNA stessu. A basa chimica di stu metudu ùn era più novu in quellu tempu: u Prughjettu Interstate Human Genome (HGP) hà aduttatu u stessu metudu ingegnosu chì Fred Sanger avia sviluppatu à a mità di l'anni 1970. L'innuvazione stava in a scala è u gradu d'automatizazione chì a sequenza era capace di ottene.
A sequenza automatizata hè stata sviluppata inizialmente in u laboratoriu di Lee Hood in l'Istitutu di Tecnulugia di California. Hà assistitu à u liceu in Montana è hà ghjucatu à u football universitariu cum'è quarterback; Grazie à Hood, a squadra hà vintu u campionatu statale più di una volta. A so cumpetenze di travagliu in squadra hè stata ancu utile in a so carriera scientifica. U laburatoriu di Hood hè stata custituita da una squadra variegata di chimichi, biuloghi è ingegneri, è u so laboratoriu diventò prestu un capu in l'innuvazione tecnologica.
In fatti, u metudu di sequencing automatizatu hè statu inventatu da Lloyd Smith è Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, tandu chì travaglia in u laboratoriu di Hood, si avvicinò à Lloyd Smith cun una pruposta per un metudu di sequenza migliuratu in quale ogni tipu di basa seria culurata diversamente. Una tale idea puderia quadruplicà l'efficienza di u prucessu Sanger. In Sanger, quandu u sequencing in ognuna di quattru tubi (sicondu u numeru di basi), cù a participazione di l'ADN polimerasi, hè furmatu un inseme unicu di oligonucleotides di diverse lunghezze, cumprese una sequenza di prima. In seguitu, a formamide hè stata aghjunta à i tubi per a separazione di a catena è l'elettroforesi di gel di poliacrilamide hè stata realizata in quattru corsi. In a versione di Smith è Hunkapiller, i didesossinucleotidi sò marcati cù quattru tinti diffirenti è a PCR hè realizata in un tubu. Allora, durante l'elettroforesi di gel di poliacrilamide, un fasciu laser in un locu specificu nantu à u gel eccita l'attività di i tinti, è u detector determina quale nucleotide hè attualmente migratu à traversu u gel. À u principiu, Smith era pessimista - temeva chì l'usu di dosi ultra-bassi di tintura porta à e regioni nucleotide indistinguibile. In ogni casu, avè una intelligenza eccellente di a tecnulugia laser, hà prestu trovu una manera di esce da a situazione cù l'usu di coloranti fluorocromi speciali chì fluoresce quandu esposti à a radiazione laser.
(Versione cumpleta - 4,08 MB) Stampa fine : sequenza di DNA sequenziata cù un sequencer automaticu, ottenuta da una macchina di sequenza automatica. Ogni culore currisponde à una di quattru basi
In a versione classica di u metudu Sanger, unu di i filamenti di l'ADN analizatu agisce cum'è un mudellu per a sintesi di un filu cumplementariu da l'enzima DNA polimerasi, dopu a sequenza di frammenti di DNA hè classificatu in un gel per dimensione. Ogni frammentu, chì hè inclusu in l'ADN durante a sintesi è permette a visualizazione sussegwente di i prudutti di reazzione, hè marcatu cù un tinte fluoriscente chì currisponde à a basa terminale (questu hè statu discutitu nantu à p. 124); dunque, a fluoriscenza di stu fragmentu serà un identificatore per una basa data. Allora tuttu ciò chì resta hè di realizà a deteczione è visualizà i prudutti di reazione. I risultati sò analizati da l'urdinatore è presentati cum'è una sequenza di picchi multicolori chì currispondenu à quattru nucleotidi. L'infurmazione hè tandu trasferitu direttamente à u sistema d'infurmazione di l'urdinatore, eliminendu u prucessu di ingressu di dati, chì dura u tempu è qualchì volta dulurosu, chì hà fattu a sequenza assai difficiule.
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Source: www.habr.com