V Kalifornii ve věku 74 let zemřel americký nositel Nobelovy ceny za chemii Kary Mullis. Podle slov jeho manželky, smrt nastala 7. srpna. Příčina — srdeční a dechová nedostatečnost způsobená pneumonií.
O tom, jaký přínos měl pro biochémii a za co získal Nobelovu cenu, nám poví sám James Watson — objevitel molekuly DNA.
Úryvek z knihy Jamese Watsona, Andrewa Berryho, Kevina Davise
DNA. Historie genetické revoluce
Kapitola 7. Genom člověka. Scénář života
…
Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla vynalezena v roce 1983 biochémičkou Kary Mullisem, který pracoval ve společnosti Cetus. Objev této reakce byl velmi výjimečný. Později Mullis vzpomínal: „Jednoho pátečního večera v dubnu 1983 mě jakoby osvítilo. Řídil jsem, projížděl po osvětlené křivolaké horské silnici v severní Kalifornii, kraji sekvojových lesů.“ Je působivé, že právě v takové situaci ho navštívila inspirace. A není to jen tím, že na severu Kalifornie jsou zvláštní silnice, které podporují osvícení; jeho přítel jednou viděl, jak se Mullis bezstarostně řítil po namrzlé silnici s obousměrným provozem a to ho vůbec nevzrušovalo. Přítel uvedl pro New York Times: „Mullisovi se zdálo, že zahyne, když narazí do sekvoje. Proto se ničeho nebojí za volantem, pokud podél silnice nerostou sekvojovce.“ Přítomnost sekvojů podél silnice nutila Mullise soustředit se a… a zde je to, osvícení. Za svůj objev v roce 1993 získal Mullis Nobelovu cenu za chemii a od té doby se jeho chování stalo ještě podivnějším. Například je zastáncem revizionistické teorie, že AIDS není spojen s HIV, což značně poškodilo jeho vlastní reputaci a bránilo lékařům.
PCR je poměrně jednoduchá reakce. K jejímu provedení potřebujeme dva chemicky syntetizované primery, komplementární k opačným koncům různých řetězců požadovaného fragmentu DNA. Primery jsou krátké úseky jednořetězcové DNA, každý přibližně 20 párů bází dlouhý. Specifičnost primerů spočívá v tom, že odpovídají úsekům DNA, které je třeba amplifikovat, tedy DNA matrici.
(Obrázek je klikací) Kary Mullis, vynálezce PCR
Specifičnost PCR spočívá v tvorbě komplementárních komplexů mezi šablonou a primery, krátkými syntetickými oligonucléotidy. Každý z primerů je komplementární k jednomu z řetězců dvouvláknové šablony a vymezuje začátek a konec amplifikované oblasti. Skutečná „šablona“ představuje celkový genom, a naším cílem je extrahovat z ní fragmenty, které nás zajímají. K tomu se dvouvláknová DNA šablona zahřívá na 95 °C na několik minut, aby se řetězce DNA oddělily. Tato fáze se nazývá denaturace, protože dochází k rozrušení vodíkových vazeb mezi dvěma řetězci DNA. Jakmile se řetězce oddělí, teplota se sníží, aby se primery mohly navázat na jednořetězcovou šablonu. DNA polymeráza začíná replikaci DNA tím, že se váže na úsek řetězce nukleotidů. Enzym DNA polymeráza replikovuje šablonový řetězec, přičemž používá primer jako startér pro kopírování. V důsledku prvního cyklu získáváme opakované sekvenční dvojnásobení určitého úseku DNA. Poté tuto proceduru opakujeme. Po každém cyklu získáváme cílovou oblast ve dvojnásobném množství. Po dvaceti pěti cyklech PCR (tj. za méně než dvě hodiny) máme požadovaný úsek DNA v množství, které je 225krát vyšší než výchozí (tj. amplifikovali jsme jej přibližně 34 milionkrát). Ve skutečnosti jsme na vstupu měli směs primerů, šablonové DNA, enzymu DNA polymerázy a volných bází A, C, G a T, přičemž množství specifického produktu reakce (omezeného primery) roste exponenciálně, zatímco množství „dlouhých“ kopií DNA lineárně, takže v produktech reakce dominuje.
Amplifikace požadovaného úseku DNA: polymerázová řetězová reakce
Na začátku používání PCR byla hlavním problémem následující situace: po každém cyklu ohřevu a chlazení bylo nutné přidávat do reakční směsi DNA polymerázu, protože při teplotě 95 °C inaktivovala. Bylo tedy nutné ji znovu přidávat před každým z 25 cyklů. Vedení reakce bylo relativně neefektivní, vyžadovalo hodně času a enzym byl poměrně drahý. Naštěstí přišla na pomoc sama příroda. Mnoho živočichů se cítí pohodlně při teplotách výrazně vyšších než 37 °C. A proč je pro nás číslo 37 °C tak důležité? Děje se tak proto, že tato teplota je optimální pro E. coli, ze které byl původně získán enzym polymerázy pro PCR. V přírodě se vyskytují mikroorganismy, jejichž proteiny se během milionů let přirozeného výběru staly odolnějšími vůči vysokým teplotám. Bylo navrženo využít DNA polymerázy z termofilních bakterií. Tyto enzymy se ukázaly jako termostabilní a byly schopny vydržet mnoho cyklů reakce. Jejich použití usnadnilo a automatizovalo provádění PCR. Jedna z prvních termostabilních DNA polymeráz byla izolována z bakterie Thermus aquaticus žijící v horkých pramenech Yellowstone, a byla nazvána Taq polymerázou.
PCR se rychle stala hlavním pracovním nástrojem projektu „Lidský genom“. Celkově proces nezměnil od návrhu Mullise, jen byl automatizován. již jsme nebyli závislí na skupině nešikovných postgraduálních studentů, kteří pečlivě přelivali kapky tekutiny do plastových zkumavek. V moderních laboratořích, které provádějí molekulárně genetická vyšetření, tuto práci vykonávají robotizované linky. PCR roboti zapojení do tak rozsáhlého sekvenovacího projektu, jako je „Lidský genom“, neúnavně pracují s obrovskými objemy teplotně odolné polymerázy. Někteří vědci pracující na projektu „Lidský genom“ byli rozhořčeni nepřiměřeně vysokými poplatky, které přidává k nákladům na spotřební materiál majitel patentu na PCR, evropský farmaceutický gigant Hoffmann-LaRoche.
Dalším "pohybujícím se prvkem" byla sama metoda sekvenování DNA. Chemický základ této metody již nebyl novinkou: Mezistátní projekt "Lidský genom" (HGP) si osvojil stejnou vysoce sofistikovanou metodu, kterou vyvinul Fred Sanger již v polovině 70. let. Inovace však spočívala v rozsahu a míře automatizace, kterých se podařilo dosáhnout při sekvenování.
Automatické sekvenování bylo původně vyvíjeno v laboratoři Leeho Huda na Kalifornském technologickém institutu. Lee dokončil školu ve státě Montana a hrál americký fotbal na pozici útočníka; díky Hudo tým několikrát vyhrál státní šampionát. Dovednosti týmové spolupráce se mu hodily i v jeho vědecké kariéře. V Huddově laboratoři pracovala pestrá skupina chemiků, biologů a inženýrů, a brzy se jeho laboratoř stala lídrem v technologických inovacích.
Ve skutečnosti metod automatického sekvenování vynalezli Lloyd Smith a Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, který tehdy pracoval v laboratoriu Huda, oslovil Lloyda Smitha s návrhem na vylepšenou metodu sekvenování, ve které by byly báze každého typu barveny každá jinou barvou. Tato myšlenka mohla čtyřikrát zvýšit efektivitu Sangerova procesu. Při sekvenování podle Sangerova postupu se v každé ze čtyř zkumavek (podle počtu bází) za účasti DNA polymerázy vytváří jedinečná sada oligonukleotidů různých délek, zahrnujících primingovou sekvenci. Poté byly do zkumavek přidány formamid pro rozpojení řetězců a provedl se elektroforéza v polyakrylamidovém gelu na čtyřech dráhách. Ve variantě Smitha a Hunkapillera se dideoxynukleotidy označují čtyřmi různými barvivy a PCR se provádí v jedné zkumavce. Poté během elektroforézy v polyakrylamidovém gelu laserový paprsek na určitém místě gelu aktivuje činnost barviv, a detektor určuje, který nukleotid v současnosti migruje přes gel. Zpočátku byl Smith naladěn pesimisticky - obával se, že použití extrémně malých dávek barviva povede k tomu, že nukleotidové úseky budou nerozlišitelné. Nicméně, s excelentní znalostí laserových technologií brzy našel řešení, kdy využil speciální fluorescenční barviva, která fluoreskují pod vlivem laserového záření.
(Plná verze — 4,08 MB) Malým písmem: sekvence DNA, kterou dekódoval automatický sekvenátor, získaná z aparátu pro automatické sekvenování. Každé barvě odpovídá jedna ze čtyř bází
V klasické variantě metody Sangerovy jedna z řetězců analyzované DNA slouží jako matice pro syntézu komplementárního řetězce enzymem DNA polymerázou, poté se sekvence fragmentů DNA třídí v gelu podle velikosti. Každý fragment, který je součástí DNA během syntézy a který umožňuje následnou vizualizaci produktů reakce, je označen fluorescenčním barvivem odpovídajícím terminálnímu základu (o tom bylo zmíněno na str. 124); tím pádem bude fluorescenční signál tohoto fragmentu identifikátorem pro daný základ. Poté zbývá pouze provést detekci a vizualizovat produkty reakce. Výsledky se analyzují pomocí počítače a prezentují se ve formě sekvence různobarevných hrotů, které odpovídají čtyřem nukleotidům. Dále je informace předána přímo do informačního systému počítače, což eliminuje časově náročný a někdy mučivý proces zadávání dat, který značně komplikoval sekvenování.
» Podrobnosti o knize naleznete na
»
»
Pro uživatele Habr sleva 25 % s kupónem — PCR
Zdroj: habr.com
