Americký laureát Nobelovy ceny za chemii Kary Mullis zemřel v Kalifornii ve věku 74 let. Podle jeho manželky k úmrtí došlo 7. srpna. Příčinou je srdeční a respirační selhání v důsledku zápalu plic.
Sám James Watson, objevitel molekuly DNA, nám povypráví o svém přínosu pro biochemii a za který dostal Nobelovu cenu.
Výňatek z knihy Jamese Watsona, Andrewa Berryho, Kevina Davise
DNA. Historie genetické revoluce
Kapitola 7. Lidský genom. Životní scénář
...
Polymerázovou řetězovou reakci (PCR) vynalezl v roce 1983 biochemik Carey Mullis, který pracoval ve společnosti Cetus. Objev této reakce byl docela pozoruhodný. Mullis později vzpomínal: „Jednoho pátečního večera v dubnu 1983 jsem měl zjevení. Seděl jsem za volantem a jel jsem po měsíčním svitu klikaté horské silnici v severní Kalifornii, zemi sekvojových lesů.“ Je působivé, že právě v takové situaci ho zasáhla inspirace. A není to tak, že by severní Kalifornie měla speciální silnice, které podporují vhled; jen jeho přítel jednou viděl Mullise, jak bezohledně uháněl po zledovatělé dvouproudové silnici, a vůbec ho to netrápilo. Jeden přítel řekl New York Times: „Mullis měl vizi, že zemře nárazem do sekvoje. Za jízdy se proto ničeho nebojí, pokud u silnice nerostou sekvoje.“ Přítomnost sekvojí podél silnice nutila Mullise soustředit se a... tady to bylo, vhled. Mullis dostal za svůj vynález v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii a od té doby se stal ve svých činech ještě podivnějším. Je například zastáncem revizionistické teorie, že AIDS nesouvisí s HIV, což výrazně podkopalo jeho vlastní pověst a překáželo lékařům.
PCR je poměrně jednoduchá reakce. K jeho provedení potřebujeme dva chemicky syntetizované primery, které jsou komplementární k opačným koncům různých řetězců požadovaného fragmentu DNA. Primery jsou krátké úseky jednořetězcové DNA, každý o délce asi 20 párů bází. Zvláštností primerů je, že odpovídají úsekům DNA, které je třeba amplifikovat, tedy templátu DNA.
(Na obrázek lze kliknout) Kary Mullis, vynálezce PCR
Specifičnost PCR je založena na tvorbě komplementárních komplexů mezi templátem a primery, krátkými syntetickými oligonukleotidy. Každý primer je komplementární k jednomu z řetězců dvouřetězcového templátu a omezuje začátek a konec amplifikované oblasti. Výsledná „matrice“ je ve skutečnosti celý genom a naším cílem je izolovat z něj fragmenty, které nás zajímají. Za tímto účelem se templát dvouřetězcové DNA zahřeje na několik minut na 95 °C, aby se oddělily řetězce DNA. Tato fáze se nazývá denaturace, protože vodíkové vazby mezi dvěma řetězci DNA jsou přerušeny. Jakmile se vlákna oddělí, teplota se sníží, aby se primerům umožnilo vázat se na jednovláknový templát. DNA polymeráza začíná replikaci DNA vazbou na úsek nukleotidového řetězce. Enzym DNA polymeráza replikuje templátový řetězec pomocí primeru jako primeru nebo příkladu pro kopírování. V důsledku prvního cyklu získáme vícenásobné sekvenční zdvojení určitého úseku DNA. Dále tento postup opakujeme. Po každém cyklu získáme cílovou oblast ve dvojnásobném množství. Po dvaceti pěti cyklech PCR (tedy za necelé dvě hodiny) máme oblast DNA, která nás zajímá, v množství 225krát větším než původní (to znamená, že jsme ji amplifikovali přibližně 34 milionůkrát). Ve skutečnosti jsme na vstupu obdrželi směs primerů, templátové DNA, enzymu DNA polymerázy a volných bází A, C, G a T, množství specifického reakčního produktu (omezeného primery) roste exponenciálně a počet „dlouhých“ kopií DNA je lineární, takže v reakci dominují produkty.
Amplifikace požadovaného úseku DNA: polymerázová řetězová reakce
V počátcích PCR byl hlavní problém následující: po každém cyklu zahřátí-ochlazení musela být do reakční směsi přidána DNA polymeráza, protože byla inaktivována při teplotě 95 ° C. Proto bylo nutné jej před každým z 25 cyklů znovu přidat. Reakční postup byl relativně neefektivní, vyžadoval mnoho času a enzymu polymerázy a materiál byl velmi drahý. Naštěstí přišla na pomoc matka příroda. Mnoho zvířat se cítí dobře při teplotách mnohem vyšších než 37 °C. Proč se pro nás stal důležitý údaj 37 °C? Stalo se tak proto, že tato teplota je optimální pro E. coli, ze které byl původně získán enzym polymeráza pro PCR. V přírodě existují mikroorganismy, jejichž proteiny se za miliony let přirozeného výběru staly odolnějšími vůči vysokým teplotám. Bylo navrženo použití DNA polymeráz z termofilních bakterií. Tyto enzymy se ukázaly jako termostabilní a byly schopny odolat mnoha reakčním cyklům. Jejich použití umožnilo zjednodušit a zautomatizovat PCR. Jedna z prvních termostabilních DNA polymeráz byla izolována z bakterie Thermus aquaticus, která žije v horkých pramenech Yellowstonského národního parku, a dostala název Taq polymeráza.
PCR se rychle stala tažným koněm projektu Human Genome Project. Obecně se proces neliší od toho, který vyvinul Mullis, byl pouze automatizován. Už jsme nebyli závislí na davu přiblblých postgraduálních studentů, kteří pracně nalévali kapičky tekutiny do plastových zkumavek. V moderních laboratořích provádějících molekulárně genetický výzkum se tato práce provádí na robotických dopravnících. Roboti PCR zapojení do sekvenačního projektu velkého jako lidský genom neúnavně pracují s obrovskými objemy tepelně stabilní polymerázy. Někteří vědci pracující na projektu Human Genome Project byli pobouřeni nepřiměřeně vysokými licenčními poplatky, které majitel patentu PCR, evropský průmyslový farmaceutický gigant Hoffmann-LaRoche, přidal k nákladům na spotřební materiál.
Dalším „hnacím principem“ byla samotná metoda sekvenování DNA. Chemický základ této metody již v té době nebyl nový: Interstate Human Genome Project (HGP) přijal stejnou důmyslnou metodu, jakou vyvinul Fred Sanger v polovině 1970. let. Inovace spočívala v rozsahu a stupni automatizace, kterého bylo sekvenování schopno dosáhnout.
Automatizované sekvenování bylo původně vyvinuto v laboratoři Lee Hooda na California Institute of Technology. Navštěvoval střední školu v Montaně a hrál univerzitní fotbal jako quarterback; Díky Hoodovi tým vyhrál státní mistrovství více než jednou. Jeho schopnosti týmové práce se mu hodily i v jeho vědecké kariéře. Hoodova laboratoř byla obsazena pestrým týmem chemiků, biologů a inženýrů a jeho laboratoř se brzy stala lídrem v technologických inovacích.
Ve skutečnosti metodu automatizovaného sekvenování vynalezli Lloyd Smith a Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, který tehdy pracoval v Hoodově laboratoři, oslovil Lloyda Smithe s návrhem na vylepšenou metodu sekvenování, ve které by byl každý typ báze zbarven jinak. Takový nápad by mohl zečtyřnásobit účinnost Sangerova procesu. V Sangerovi se při sekvenování v každé ze čtyř zkumavek (podle počtu bází) za účasti DNA polymerázy vytvoří unikátní sada různě dlouhých oligonukleotidů včetně sekvence primeru. Dále byl do zkumavek přidán formamid pro separaci řetězců a byla provedena elektroforéza na polyakrylamidovém gelu na čtyřech drahách. Ve verzi Smithe a Hunkapillera jsou dideoxynukleotidy značeny čtyřmi různými barvivy a PCR se provádí v jedné zkumavce. Poté během elektroforézy na polyakrylamidovém gelu laserový paprsek na určitém místě na gelu vybudí aktivitu barviv a detektor určí, který nukleotid právě migruje gelem. Smith byl zpočátku pesimistický – obával se, že použití ultranízkých dávek barviva povede k nerozlišitelnosti nukleotidových oblastí. Vzhledem k vynikající znalosti laserové technologie však brzy našel východisko ze situace pomocí speciálních fluorochromových barviv, která při vystavení laserovému záření fluoreskují.
(Plná verze - 4,08 MB) Drobným písmem: DNA sekvence sekvenovaná pomocí automatického sekvenátoru, získaná z automatického sekvenačního stroje. Každá barva odpovídá jednomu ze čtyř základů
V klasické verzi Sangerovy metody funguje jeden z řetězců analyzované DNA jako templát pro syntézu komplementárního řetězce enzymem DNA polymerázou, poté se sekvence fragmentů DNA třídí v gelu podle velikosti. Každý fragment, který je obsažen v DNA při syntéze a umožňuje následnou vizualizaci reakčních produktů, je značen fluorescenčním barvivem odpovídajícím terminální bázi (to bylo diskutováno na str. 124); proto fluorescence tohoto fragmentu bude identifikátorem pro danou bázi. Pak už zbývá jen provést detekci a vizualizovat reakční produkty. Výsledky jsou analyzovány počítačem a prezentovány jako sekvence vícebarevných píku odpovídajících čtyřem nukleotidům. Informace jsou poté přeneseny přímo do informačního systému počítače, čímž odpadá časově náročný a někdy bolestivý proces zadávání dat, který velmi ztěžoval sekvenování.
» Více podrobností o knize naleznete na
»
»
Pro Khabrozhiteley 25% slevu pomocí kupónu - PCR
Zdroj: www.habr.com