I Californien er den amerikanske nobelprisvinder i kemi, Cary Mullis, død i en alder af 74 år. Ifølge hans kone indtrådte dødsfaldet den 7. august. Årsagen var hjerte- og respirationssvigt som følge af lungebetændelse.
James Watson, opdageren af DNA-molekylet, fortæller os om det bidrag, han har givet til biokemi, og hvorfor han modtog Nobelprisen.
Uddrag fra bogen af James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Historien om den genetiske revolution
Kapitel 7. Menneskets genom. Livets scenarie
…
Polymerase kædereaktion (PCR) blev opfundet i 1983 af biokemikeren Cary Mullis, der arbejdede hos Cetus. Opdagelsen af denne reaktion var bemærkelsesværdig. Senere huskede Mullis: "En fredag aften i april 1983 blev jeg pludselig oplyst. Jeg kørte langs en måneskinnet snoet bjergvej i Nordcalifornien, nær sekvovierne." Det er bemærkelsesværdigt, at inspirationen kom i en sådan situation. Det handler slet ikke om, at vejene i Nordcalifornien fremmer sådanne indsigter; det var bare, at hans ven engang havde set Mullis køre uforsigtigt på en iset vej med begge retninger fuld, hvilket slet ikke bekymrede ham. Vennen fortalte New York Times: "Mullis forestillede sig, at han ville dø ved at køre ind i en sekvoj. Derfor er han ikke bange for at køre, så længe der ikke vokser sekvojer langs vejen." Tilstedeværelsen af sekvojer langs vejen fik Mullis til at fokusere, og... der var inspirationen. For sin opfindelse modtog Mullis Nobelprisen i kemi i 1993 og blev siden endnu mere excentrisk i sine handlinger. For eksempel er han en tilhænger af den revisionistiske teori om, at AIDS ikke er relateret til HIV, hvilket væsentligt svækkede hans eget omdømme og forstyrrede lægerne.
PCR er en ret simpel reaktion. For at udføre den kræver vi to kemisk syntetiserede primere, der er komplementære til de modsatte ender af de forskellige kedler af den ønskede DNA-fragment. Primerne er korte segmenter af enkeltstrenget DNA, hver cirka 20 basepar lange. Det særlige ved primerne er, at de passer til de DNA-segmenter, der skal amplificeres, det vil sige DNA-matrixen.
(Billedet kan klikkes) Cary Mullis, opfinderen af PCR
Specificiteten af PCR er baseret på dannelsen af komplementære komplekser mellem skabelonen og primere, som er korte syntetiske oligonukleotider. Hver primer er komplementær til en af trådene i den dobbeltstrengede skabelon og begrænser begyndelsen og slutningen af det amplificerede område. Den faktiske "skabelon" repræsenterer et helt genom, og vores mål er at isolere de fragmenter, vi er interesseret i. For dette formål opvarmes den dobbeltstrengede DNA-skabelon til 95 °C i flere minutter, så DNA-trådene adskilles. Denne fase kaldes denaturering, da hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge brydes. Når strængerne er adskilt, sænkes temperaturen, så primerne kan binde sig til den enkeltstrengede skabelon. DNA-polymerasen begynder at replikere DNA ved at binde sig til segmentet af nukleotider. Enzymet DNA-polymerase replikerer skabelonstrengen ved at bruge primeren som en skabelon eller eksempel til kopiering. Som et resultat af den første cyklus opnår vi en gentagen sekvensiel fordobling af et bestemt DNA-område. Derefter gentager vi denne procedure. Efter hver cyklus får vi målet i dobbelt antal. Efter femogtyve cykler PCR (det vil sige på mindre end to timer) har vi det DNA-område, vi er interesseret i, i en mængde der overstiger den oprindelige med 225 gange (dvs. vi har amplificeret det omkring 34 millioner gange). Faktisk havde vi ved indgangen en blanding af primere, skabelon-DNA, DNA-polymeraseenzym og frie nukleotider A, C, G og T. Mængden af det specifikke reaktionsprodukt (begrænset af primerne) vokser eksponentielt, mens mængden af "lange" DNA-kopier vokser lineært, så det specifikke produkt dominerer i reaktionsprodukterne.
Amplifikation af det ønskede DNA-område: polymerasekædereaktion
Ved begyndelsen af PCR blev hovedproblemet følgende: efter hver cyklus af opvarmning-og-afkøling skulle der tilsættes DNA-polymerase til reaktionsblandingen, da den blev inaktiveret ved en temperatur på 95 °C. Derfor var det nødvendigt at tilsætte den igen før hver af de 25 cyklusser. Proceduren for at udføre reaktionen var relativt ineffektiv, krævede meget tid og polymeraseenzym, hvilket var ret kostbart. Heldigvis kom moder natur til hjælp. Mange dyr trives ved temperaturer meget over 37 °C. Men hvorfor blev tallet 37 °C vigtigt for os? Det skete, fordi denne temperatur er optimal for E. coli, som oprindeligt blev anvendt til at udvinde polymeraseenzymet til PCR. I naturen findes der mikroorganismer, hvis proteiner gennem millioner af års naturlig selektion er blevet mere modstandsdygtige over for høje temperaturer. Det blev foreslået at bruge DNA-polymeraser fra termofile bakterier. Disse enzymer viste sig at være termostabile og kunne tåle mange reaktionscykler. Deres anvendelse blev enkle og automatiserede PCR-processen. En af de første termostabile DNA-polymeraser blev udvundet fra bakterien Thermus aquaticus, som lever i de varme kilder i Yellowstone nationalpark, og blev kaldt Taq-polymerase.
PCR er hurtigt blevet den primære arbejdshest for projektet "Menneskets genom". Generelt adskiller processen sig ikke fra den, der blev udviklet af Mullis; den er blot blevet automatiseret. Vi var ikke længere afhængige af en flok halvmørke ph.d.-studerende, der flittigt hældte dråber væske i plastikprøverør. I moderne laboratorier, der udfører molekylærgenetiske undersøgelser, udføres dette arbejde på robotter. PCR-robotter, der er involveret i et så stort sekventeringsprojekt som "Menneskets genom", arbejder uophørligt med enorme mængder termostabil polymerase. Nogle forskere, der arbejder på "Menneskets genom"-projektet, var oprørt over de urimeligt høje gebyrer, som indehaveren af patentet på PCR, det europæiske industri-farmaceutiske gigant Hoffmann-LaRoche, tilføjer omkostningerne til forbrugsstofferne.
En anden "drivkraft" var selve metoden til DNA-sekvensering. Den kemiske basis for denne metode var på det tidspunkt allerede velkendt: Det interstatslige projekt "Menneskets Genom" (HGP) tog i brug den samme geniale metode, som blev udviklet af Fred Sanger i midten af 1970'erne. Innovationen bestod imidlertid i omfanget og graden af automatisering, som blev opnået under sekvenseringen.
Automatisk sekvensering blev oprindeligt udviklet i Lee Huds laboratorium ved Caltech. Han afsluttede sin skolegang i Montana og spillede amerikansk fodbold som angriber; takket være Hud vandt holdet flere gange statsmesterskabet. Hans evner inden for teamwork kom ham også til gode i hans videnskabelige karriere. I Huds laboratorium arbejdede en broget gruppe af kemikere, biologer og ingeniører, og snart blev hans laboratorium førende inden for teknologiske innovationer.
Faktisk blev metoden til automatisk sekvensering opfundet af Lloyd Smith og Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, der dengang arbejdede i Hood-laboratoriet, henvendte sig til Lloyd Smith med et forslag til en forbedret sekvenseringsmetode, hvor baserne skulle farves i hver sin farve. Denne idé kunne øge effektiviteten af Sanger-processen fire gange. I Sanger-metoden dannes der under sekvensering i hver af de fire prøver (svarende til antallet af baser) et unikt sæt oligonukleotider i forskellig længde ved hjælp af DNA-polymerase, som inkluderer primersekvensen. Derefter tilsættes formamid til prøverne for at adskille kæderne, og der udføres elektroforese i et polyacrylamidgel i fire baner. I Smiths og Hunkapillers version mærkes didesoxynukleotiderne med fire forskellige farvestoffer, og PCR udføres i én prøve. Under elektroforese i polyacrylamidgelen aktiverer en laserstråle på et bestemt sted i gelen farvestoffernes aktivitet, og detektoren bestemmer, hvilken nucleotide der i øjeblikket migrerer gennem gelen. Først var Smith pessimistisk — han var bange for, at brugen af ultralave doser farvestof ville gøre, at nucleotide-segmenterne ville være umulige at skelne. Men med sin fremragende forståelse af laserteknologier fandt han snart en løsning ved at bruge specielle fluorescerende farvestoffer, der fluorescerer under laserstråling.
(Fuldt version — 4,08 MB) Med småt: DNA-sekvensen, der blev dechifreret ved hjælp af en automatisk sekvenserer, der er taget fra en automatisk sekvenseringsmaskine. Hver farve svarer til en af de fire baser
I den klassiske version af Sanger-metoden fungerer en af de DNA-strenge, der analyseres, som en matrix for syntese af den komplementære streng ved hjælp af DNA-polymerase. Derefter sorteres DNA-fragmenterne i gelen efter størrelse. Hvert fragment, der indgår i DNA under syntesen og som senere gør det muligt at visualisere reaktionsprodukterne, mærkes med en fluorescerende farvestof, der svarer til det terminale base (dette blev nævnt på s. 124); derfor vil fluorescens af dette fragment være en identifikator for den pågældende base. Derefter er det kun nødvendigt at udføre detektion og visualisere reaktionsprodukterne. Resultaterne analyseres med en computer og præsenteres i form af en sekvens af farverige toppe, der svarer til de fire nukleotider. Informationen overføres derefter direkte til computerens informationssystem, hvilket udelukker den tidskrævende og til tider besværlige dataindtastningsproces, der i høj grad komplicerede sekventeringen.
» Mere information om bogen kan findes på
»
»
For Habr-læsere er der 25% rabat med koden — PCR
Kilde: habr.com
