Den amerikanske nobelpristager i kemi Kary Mullis døde i Californien i en alder af 74. Ifølge hans kone skete døden den 7. august. Årsagen er hjerte- og åndedrætssvigt på grund af lungebetændelse.
James Watson selv, opdageren af DNA-molekylet, vil fortælle os om sit bidrag til biokemi, og som han modtog Nobelprisen for.
Uddrag fra bogen af James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Historien om den genetiske revolution
Kapitel 7. Menneskets genom. Livsscenarie
...
Polymerasekædereaktionen (PCR) blev opfundet i 1983 af biokemikeren Carey Mullis, som arbejdede hos Cetus. Opdagelsen af denne reaktion var ret bemærkelsesværdig. Mullis huskede senere: „En fredag aften i april 1983 havde jeg en åbenbaring. Jeg sad bag rattet og kørte ned ad en månebelyst, snoet bjergvej i det nordlige Californien, redwood-skovenes land." Det er imponerende, at det var i sådan en situation, at inspirationen ramte ham. Og det er ikke sådan, at det nordlige Californien har særlige veje, der fremmer indsigt; det er bare det, at hans ven engang så Mullis køre hensynsløst fremad langs en iskolt dobbelt kørebane, og det generede ham overhovedet ikke. En ven fortalte New York Times: "Mullis havde en vision om, at han ville dø ved at styrte ind i et redwood-træ. Derfor er han ikke bange for noget, mens han kører, medmindre der vokser redwood-træer langs vejen.” Tilstedeværelsen af redwoods langs vejen tvang Mullis til at koncentrere sig og... her var det et indblik. Mullis modtog Nobelprisen i kemi for sin opfindelse i 1993 og er siden blevet endnu mere fremmed i sine handlinger. For eksempel er han tilhænger af den revisionistiske teori om, at AIDS ikke er relateret til HIV, hvilket markant underminerede hans eget omdømme og forstyrrede lægerne.
PCR er en ret simpel reaktion. For at udføre det har vi brug for to kemisk syntetiserede primere, der er komplementære til de modsatte ender af forskellige strenge af det nødvendige DNA-fragment. Primere er korte sektioner af enkeltstrenget DNA, hver omkring 20 basepar i længden. Det særlige ved primere er, at de svarer til de DNA-sektioner, der skal amplificeres, det vil sige DNA-skabelonen.
(Klikbart billede) Kary Mullis, opfinder af PCR
Specificiteten af PCR er baseret på dannelsen af komplementære komplekser mellem skabelonen og primerne, korte syntetiske oligonukleotider. Hver primer er komplementær til en af strengene i den dobbeltstrengede template og begrænser begyndelsen og slutningen af den amplificerede region. Faktisk er den resulterende "matrix" et helt genom, og vores mål er at isolere de fragmenter af interesse for os fra det. For at gøre dette opvarmes den dobbeltstrengede DNA-skabelon til 95 °C i flere minutter for at adskille DNA-strengene. Dette stadie kaldes denaturering, fordi hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge er brudt. Når strengene er adskilt, sænkes temperaturen for at tillade primerne at binde til den enkeltstrengede skabelon. DNA-polymerase begynder DNA-replikation ved at binde sig til en strækning af nukleotidkæden. Enzymet DNA-polymerase replikerer skabelonstrengen under anvendelse af en primer som en primer eller et eksempel til kopiering. Som et resultat af den første cyklus opnår vi multiple sekventielle fordoblinger af en bestemt DNA-sektion. Dernæst gentager vi denne procedure. Efter hver cyklus opnår vi et målområde i dobbelt mængde. Efter femogtyve PCR-cyklusser (det vil sige på mindre end to timer) har vi DNA-området af interesse for os i en mængde, der er 225 gange højere end originalen (det vil sige, vi har amplificeret den ca. 34 millioner gange). Faktisk modtog vi ved input en blanding af primere, template-DNA, DNA-polymeraseenzym og frie baser A, C, G og T, mængden af et specifikt reaktionsprodukt (begrænset af primere) vokser eksponentielt, og antallet af " lange” DNA-kopier er lineære, så reaktionsprodukter dominerer.
Amplifikation af den ønskede DNA-sektion: polymerasekædereaktion
I de tidlige dage af PCR var hovedproblemet følgende: efter hver opvarmnings-afkølingscyklus skulle DNA-polymerase tilsættes til reaktionsblandingen, da den blev inaktiveret ved en temperatur på 95 ° C. Derfor var det nødvendigt at tilføje det igen før hver af de 25 cyklusser. Reaktionsproceduren var relativt ineffektiv, krævede meget tid og polymeraseenzymet, og materialet var meget dyrt. Heldigvis kom Moder Natur til undsætning. Mange dyr føler sig godt tilpas ved temperaturer meget højere end 37 °C. Hvorfor blev tallet 37 °C vigtigt for os? Dette skete, fordi denne temperatur er optimal for E. coli, hvorfra polymeraseenzymet til PCR oprindeligt blev opnået. I naturen er der mikroorganismer, hvis proteiner gennem millioner af års naturlig udvælgelse er blevet mere modstandsdygtige over for høje temperaturer. Det er blevet foreslået at anvende DNA-polymeraser fra termofile bakterier. Disse enzymer viste sig at være termostabile og var i stand til at modstå mange reaktionscyklusser. Deres brug gjorde det muligt at forenkle og automatisere PCR. En af de første termostabile DNA-polymeraser blev isoleret fra bakterien Thermus aquaticus, som lever i de varme kilder i Yellowstone National Park, og fik navnet Taq polymerase.
PCR blev hurtigt arbejdshesten i Human Genome Project. Generelt er processen ikke anderledes end den, der er udviklet af Mullis, den er netop blevet automatiseret. Vi var ikke længere afhængige af en skare af uklare kandidatstuderende, der møjsommeligt hældte dråber væske i plastikreagensglas. I moderne laboratorier, der udfører molekylær genetisk forskning, udføres dette arbejde på robottransportører. PCR-robotter involveret i et sekventeringsprojekt så stort som det menneskelige genom arbejder ubønhørligt med enorme mængder af varmestabil polymerase. Nogle videnskabsmænd, der arbejder på Human Genome Project, var forargede over de urimeligt høje royalties, der blev tilføjet til prisen på forbrugsvarer af ejeren af PCR-patentet, den europæiske industrielle farmaceutiske gigant Hoffmann-LaRoche.
Et andet "drivprincip" var selve DNA-sekventeringsmetoden. Det kemiske grundlag for denne metode var ikke længere nyt på det tidspunkt: Interstate Human Genome Project (HGP) adopterede den samme geniale metode, som Fred Sanger havde udviklet tilbage i midten af 1970'erne. Innovationen lå i omfanget og graden af automatisering, som sekventering var i stand til at opnå.
Automatiseret sekventering blev oprindeligt udviklet i Lee Hoods laboratorium ved California Institute of Technology. Han gik på gymnasiet i Montana og spillede college-fodbold som quarterback; Takket være Hood vandt holdet statsmesterskabet mere end én gang. Hans teamwork-evner kom også til nytte i hans videnskabelige karriere. Hoods laboratorium var bemandet af en broget besætning af kemikere, biologer og ingeniører, og hans laboratorium blev hurtigt førende inden for teknologisk innovation.
Faktisk blev den automatiserede sekventeringsmetode opfundet af Lloyd Smith og Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, der dengang arbejdede i Hoods laboratorium, henvendte sig til Lloyd Smith med et forslag til en forbedret sekventeringsmetode, hvor hver type base ville blive farvet forskelligt. En sådan idé kunne firdoble effektiviteten af Sanger-processen. I Sanger, når der sekventeres i hvert af fire rør (i henhold til antallet af baser), med deltagelse af DNA-polymerase, dannes et unikt sæt oligonukleotider af forskellig længde, inklusive en primersekvens. Derefter blev formamid tilsat til rørene til kædeseparation, og polyacrylamidgelelektroforese blev udført på fire baner. I Smith og Hunkapillers version er dideoxynukleotider mærket med fire forskellige farvestoffer og PCR udføres i ét rør. Derefter, under polyacrylamidgelelektroforese, exciterer en laserstråle på et bestemt sted på gelen farvestoffernes aktivitet, og detektoren bestemmer, hvilket nukleotid der i øjeblikket migrerer gennem gelen. Til at begynde med var Smith pessimistisk - han frygtede, at brug af ultralave doser farvestof ville føre til, at nukleotidregionerne ikke kunne skelnes. Men med en fremragende forståelse af laserteknologi fandt han hurtigt en vej ud af situationen ved at bruge specielle fluorokromfarvestoffer, der fluorescerer, når de udsættes for laserstråling.
(Fulde version - 4,08 MB) Med småt: DNA-sekvens sekventeret ved hjælp af en automatisk sekventeringsmaskine, hentet fra en automatisk sekventeringsmaskine. Hver farve svarer til en af fire baser
I den klassiske version af Sanger-metoden fungerer en af strengene i det analyserede DNA som skabelon for syntesen af en komplementær streng af enzymet DNA-polymerase, derefter sorteres sekvensen af DNA-fragmenter i en gel efter størrelse. Hvert fragment, som er inkluderet i DNA'et under syntesen og tillader efterfølgende visualisering af reaktionsprodukter, er mærket med et fluorescerende farvestof svarende til den terminale base (dette blev diskuteret på s. 124); derfor vil fluorescensen af dette fragment være en identifikator for en given base. Så er der kun tilbage at udføre detektion og visualisere reaktionsprodukterne. Resultaterne analyseres ved hjælp af computer og præsenteres som en sekvens af flerfarvede toppe svarende til fire nukleotider. Informationen overføres derefter direkte til computerens informationssystem, hvilket eliminerer den tidskrævende og til tider smertefulde dataindtastningsproces, der gjorde sekventering meget vanskelig.
» Flere detaljer om bogen kan findes på
»
»
For Khabrozhiteley 25% rabat ved brug af kupon - PCR
Kilde: www.habr.com