In Kalifornien ist der amerikanische Nobelpreisträger für Chemie Kary Mullis im Alter von 74 Jahren gestorben. Laut seiner Ehefrau verstarb er am 7. August. Die Todesursache war Herz- und Atemversagen aufgrund von Pneumonie.
Was seinen Beitrag zur Biochemie und den Grund für den Erhalt des Nobelpreises betrifft, wird uns James Watson – der Entdecker der DNA-Moleküle – berichten.
Ein Auszug aus dem Buch von James Watson, Andrew Berry, Kevin Davies.
DNA. Die Geschichte der genetischen Revolution.
Kapitel 7. Das menschliche Genom. Lebensszenario.
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde 1983 von dem Biochemiker Kary Mullis, der bei der Firma Cetus arbeitete, erfunden. Die Entdeckung dieser Reaktion war bemerkenswert. Später erinnerte sich Mullis: "Eines Freitagnachts im April 1983 wurde ich plötzlich erleuchtet. Ich fuhr, während ich die kurvenreiche Bergstraße im von Mondlicht erhellten Nordkalifornien entlangrollte, wo sich die Mammutbaumwälder befinden." Es ist beeindruckend, dass ihn in einem solchen Moment die Inspiration überkam. Und es liegt nicht daran, dass die Straßen im Nordkalifornien besonders erscheinen, die solche Erleuchtungen fördern; viel mehr ist es so, dass ein Freund einmal gesehen hatte, wie Mullis rücksichtslos auf einer vereisten Straße mit Gegenverkehr fuhr, und das störte ihn überhaupt nicht. Der Freund berichtete der New York Times Folgendes: "Mullis träumte, dass er sterben würde, als er gegen einen Mammutbaum prallte. Deshalb hat er beim Fahren keine Angst, solange keine Mammutbäume am Straßenrand wachsen." Das Vorhandensein von Mammutbäumen entlang der Straße ließ Mullis konzentriert bleiben und... da war es, die Erleuchtung. Für seine Erfindung erhielt Mullis 1993 den Nobelpreis für Chemie und seitdem wurde er in seinen Handlungen noch merkwürdiger. Zum Beispiel ist er ein Befürworter der revisionistischen Theorie, dass AIDS nicht mit HIV in Verbindung steht, was seinen eigenen Ruf erheblich geschädigt hat und die Ärzte behindert hat.
PCR ist eine relativ einfache Reaktion. Für ihre Durchführung benötigen wir zwei chemisch synthetisierte Primer, die komplementär zu den entgegengesetzten Enden verschiedener Stränge des gewünschten DNA-Fragments sind. Primer sind kurze Abschnitte einzelsträngiger DNA, jeder etwa 20 Basenpaare lang. Die Besonderheit der Primer besteht darin, dass sie den DNA-Abschnitten entsprechen, die amplifiziert werden sollen, also der DNA-Matrix.
(Das Bild ist klickbar) Kary Mullis, Erfinder der PCR
Die Spezifität der PCR basiert auf der Bildung komplementärer Komplexe zwischen der Matrize und den Primern, kurzen synthetischen Oligonukleotiden. Jeder Primer ist komplementär zu einem der Stränge der doppelsträngigen Matrize und definiert den Beginn und das Ende des amplifizierbaren Abschnitts. Tatsächlich stellt die erhaltene "Matrize" das vollständige Genom dar, und unser Ziel ist es, die für uns interessanten Fragmente daraus zu isolieren. Zu diesem Zweck wird die doppelsträngige DNA-Matrize für einige Minuten auf 95 °C erhitzt, sodass sich die DNA-Stränge trennen. Diese Phase wird als Denaturierung bezeichnet, da die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA-Strängen zerbrochen werden. Wenn sich die Stränge getrennt haben, wird die Temperatur gesenkt, damit die Primer sich mit der einzelsträngigen Matrize verbinden können. Die DNA-Polymerase beginnt mit der DNA-Replikation, indem sie sich an ein Segment der Nukleotidkette anlagert. Das Enzym DNA-Polymerase repliziert den Matrizenstrang und verwendet den Primer als Ausgangspunkt oder Vorlage für die Kopie. Im Ergebnis des ersten Zyklus erhalten wir eine mehrfache, aufeinanderfolgende Verdopplung eines bestimmten DNA-Abschnitts. Danach wiederholen wir dieses Verfahren. Nach jedem Zyklus erhalten wir das Zielgebiet in doppelter Menge. Nach fünfundzwanzig PCR-Zyklen (also in weniger als zwei Stunden) haben wir den interessierenden DNA-Abschnitt in einer Menge, die das Ausgangsmaterial um das 225-fache übersteigt (wir haben ihn also etwa 34 Millionen Mal amplifiziert). Tatsächlich hatten wir zu Beginn eine Mischung aus Primern, Matrizen-DNA, dem Enzym DNA-Polymerase und freien Basen A, C, G und T, wobei die Menge des spezifischen Reaktionsprodukts (begrenzte Primer) exponentiell wächst, während die Anzahl der "langen" DNA-Kopien linear wächst, sodass in den Reaktionsprodukten die Dominanz besteht.
Amplifikation des benötigten DNA-Areals: Polymerase-Kettenreaktion
In den frühen Tagen der PCR gab es ein grundlegendes Problem: Nach jedem Zyklus von Erwärmen und Abkühlen musste DNA-Polymerase zur Reaktion hinzugefügt werden, da sie bei 95 °C inaktiv wurde. Daher musste sie vor jedem der 25 Zyklen erneut hinzugefügt werden. Das Verfahren zur Durchführung der Reaktion war vergleichsweise ineffizient, zeitaufwändig und benötigte eine Menge Polymerase, die relativ teuer ist. Glücklicherweise kam die Natur zur Hilfe. Viele Tiere fühlen sich bei Temperaturen weit über 37 °C wohl. Aber warum ist für uns die Zahl 37 °C so wichtig? Das liegt daran, dass diese Temperatur optimal für E. coli ist, aus der das Enzym Polymerase für die PCR ursprünglich gewonnen wurde. In der Natur gibt es Mikroorganismen, deren Proteine durch Millionen Jahre natürliche Selektion hitzebeständiger geworden sind. Es wurde vorgeschlagen, DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien zu verwenden. Diese Enzyme erwiesen sich als thermostabil und waren in der Lage, viele Reaktionszyklen zu überstehen. Ihr Einsatz ermöglichte die Vereinfachung und Automatisierung der PCR. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus isoliert, das in den heißen Quellen des Yellowstone-Nationalparks vorkommt, und erhielt den Namen Taq-Polymerase.
Die PCR hat sich schnell zur Hauptarbeitspferd des Projekts "Humangenom" entwickelt. Im Grunde unterscheidet sich der Prozess nicht von dem, was Mullis entwickelt hat, er wurde lediglich automatisiert. Wir waren nicht mehr von einer Gruppe halbblinder Doktoranden abhängig, die mühsam Tropfen Flüssigkeit in Plastikrohren umfüllten. In modernen Laboren, die molekulargenetische Untersuchungen durchführen, wird diese Arbeit auf robotergestützten Förderbändern erledigt. Die PCR-Roboter, die in einem so umfassenden Projekt wie dem "Humangenom" aktiv sind, arbeiten unermüdlich mit riesigen Mengen an thermoresistenter Polymerase. Einige Wissenschaftler, die an dem Projekt "Humangenom" beteiligt sind, waren empört über die unangemessen hohen Abgaben, die der Patentinhaber der PCR, der europäische Industrie-Pharmagigant Hoffmann-LaRoche, zu den Kosten der Verbrauchsmaterialien hinzufügt.
Ein weiterer "motorischer Antrieb" war die Sequenzierungsmethode selbst. Die chemische Basis dieser Methode war zu diesem Zeitpunkt bereits nicht neu: Das interstaatliche Projekt "Human Genome Project" (HGP) übernahm dieselbe raffinierte Methode, die Fred Sanger bereits in den 1970er Jahren entwickelt hatte. Die Innovation lag jedoch im Umfang und in dem Automatisierungsgrad, die bei der Sequenzierung erreicht wurden.
Die automatische Sequenzierung wurde ursprünglich im Labor von Lee Hood am California Institute of Technology entwickelt. Er schloss die Schule im Bundesstaat Montana ab und spielte American Football als Offensive Player; dank Hood gewann das Team mehrmals die Meisterschaft des Bundesstaates. Seine Teamfähigkeit kam ihm auch in seiner wissenschaftlichen Karriere zugute. Im Labor von Hood arbeitete eine bunte Mischung aus Chemikern, Biologen und Ingenieuren, und bald wurde sein Labor führend in technologischen Innovationen.
Tatsächlich wurden die Methoden zur automatischen Sequenzierung von Lloyd Smith und Mike Hunkapiller erfunden. Mike Hunkapiller, der damals im Hud-Labor arbeitete, wandte sich an Lloyd Smith und schlug ihm eine verbesserte Sequenzierungsmethode vor, bei der die Basen jedes Typs in verschiedenen Farben gefärbt werden. Diese Idee hatte das Potenzial, die Effizienz des Sanger-Prozesses um das Vierfache zu steigern. Bei Sanger entsteht beim Sequenzieren in jedem der vier Gefäße (entsprechend der Anzahl der Basen) ein einzigartiges Set von Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge, das die Primersequenz enthält, unter Mitwirkung der DNA-Polymerase. Anschließend wurde Formamid zu den Proben gegeben, um die Stränge zu trennen und es wurde Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel auf vier Bahnen durchgeführt. In der Variante von Smith und Hunkapiller wurden Dideoxynukleotide mit vier verschiedenen Farbstoffen markiert und die PCR in einem einzigen Gefäß durchgeführt. Während der Elektrophorese im Polyacrylamidgel aktiviert ein Laserstrahl an einem bestimmten Punkt des Gels die Aktivität der Farbstoffe, und der Detektor bestimmt, welche Nukleotid gerade durch das Gel wandert. Zunächst war Smith skeptisch und befürchtete, dass die Verwendung von extrem geringen Farbstoffdosen dazu führen würde, dass die Nukleotidabschnitte nicht erkennbar sind. Doch da er hervorragende Kenntnisse in Lasertechnologien besaß, fand er bald eine Lösung, indem er spezielle fluoreszierende Farbstoffe einsetzte, die unter Laserbestrahlung fluoreszieren.
(Vollversion — 4,08 MB) Klein geschrieben: Die DNA-Sequenz, die mit einem automatischen Sequenzierer entschlüsselt wurde, stammt von einem Gerät zur automatischen Sequenzierung. Jeder Farbe entspricht eine der vier Basen.
Im klassischen Ansatz der Sanger-Methode dient eine der analysierten DNA-Stränge als Matrize für die Synthese der komplementären Stränge durch die DNA-Polymerase. Anschließend werden die DNA-Fragmente im Gel nach Größe sortiert. Jeder fragmentierte Teil, der während der Synthese in die DNA integriert wird und die Visualisierung der Reaktionsprodukte ermöglicht, wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der dem terminalen Basenpaar entspricht (dazu siehe S. 124); die Fluoreszenz dieses Fragmentes fungiert somit als Identifikator für die jeweilige Base. Danach bleibt nur noch, die Produkte der Reaktion zu detektieren und zu visualisieren. Die Ergebnisse werden mithilfe eines Computers analysiert und in Form einer Sequenz farbiger Spitzen dargestellt, die den vier Nukleotiden entsprechen. Die Informationen werden direkt in das Informationssystem des Computers übertragen, was den zeitaufwändigen und oft mühsamen Prozess der Dateneingabe ausschließt, der das Sequenzieren erheblich erschwerte.
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Quelle: habr.com
