In Kalifornien ist der amerikanische Nobelpreisträger für Chemie Carey Mullis im Alter von 74 Jahren verstorben. Laut seiner Frau trat der Tod am 7. August ein. Grund waren Herz- und Atemversagen aufgrund von Lungenentzündung.
Welchen Beitrag er zur Biochemie geleistet hat und wofür er den Nobelpreis erhalten hat, wird uns James Watson, der Entdecker des DNA-Moleküls, selbst erzählen.
Auszug aus dem Buch von James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Die Geschichte der genetischen Revolution
Kapitel 7. Das menschliche Genom. Lebensszenario
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde 1983 von dem Biochemiker Carey Mullis, der bei der Firma Cetus arbeitete, erfunden. Die Entdeckung dieser Reaktion war durchaus bemerkenswert. Später erinnerte sich Mullis: „Eines Freitagabends im April 1983 hatte ich eine Art Erleuchtung. Ich fuhr auf einer von Mondlicht überfluteten, kurvenreichen Bergstraße in Nordkalifornien, am Rand eines Sequoia-Waldes.“ Es ist beeindruckend, dass ihn gerade in solch einer Situation die Inspiration traf. Und es liegt nicht daran, dass die Straßen in Nordkalifornien besonders sind und Erleuchtungen fördern; einfach gesagt, seinem Freund war einmal aufgefallen, dass Mullis rücksichtslos auf einer vereisten Straße mit zwei Fahrspuren raste, was ihn völlig unbeeindruckt ließ. Ein Freund sagte der New York Times: „Mullis träumte, dass er sterben würde, indem er in einen Sequoia-Baum fährt. Deshalb hat er am Steuer keine Angst, wenn am Straßenrand keine Sequoias wachsen.“ Die Anwesenheit von Sequoias entlang der Straße ließ Mullis sich konzentrieren und… da war die Erleuchtung. Für seine Erfindung erhielt Mullis 1993 den Nobelpreis für Chemie und wurde seitdem in seinem Verhalten noch merkwürdiger. Zum Beispiel ist er ein Befürworter einer revisionistischen Theorie, wonach AIDS nicht mit HIV in Verbindung steht, was seinen eigenen Ruf erheblich schädigte und den Ärzten schadete.
PCR ist eine recht einfache Reaktion. Um sie durchzuführen, benötigen wir zwei chemisch synthetisierte Primer, die komplementär zu den gegenüberliegenden Enden verschiedener Stränge des gewünschten DNA-Fragments sind. Primer sind kurze Abschnitte einsträngiger DNA, jeder etwa 20 Basenpaare lang. Das Besondere an den Primern ist, dass sie den DNA-Bereichen entsprechen, die amplifiziert werden sollen, also der DNA-Matrix.
(Bild anklickbar) Carey Mullis, Erfinder der PCR
Die Spezifität der PCR basiert auf der Bildung komplementärer Komplexe zwischen der Matrize und den Primern, kurzen synthetischen Oligonukleotiden. Jeder Primer ist komplementär zu einem der Stränge der doppelsträngigen Matrize und begrenzt den Anfang und das Ende des amplifizierbaren Bereichs. Tatsächlich stellt die erhaltene „Matrize“ das gesamte Genom dar, und unser Ziel ist es, die für uns interessanten Fragmente daraus zu extrahieren. Zu diesem Zweck wird die doppelsträngige DNA-Matrize für einige Minuten auf 95 °C erhitzt, damit sich die DNA-Stränge trennen. Diese Phase wird als Denaturierung bezeichnet, da die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden DNA-Strängen zerstört werden. Wenn sich die Stränge getrennt haben, wird die Temperatur gesenkt, damit die Primer an die einzelsträngige Matrize binden können. Die DNA-Polymerase beginnt mit der Replikation der DNA, indem sie sich an einem Abschnitt der Nukleotidkette anlagert. Das Enzym DNA-Polymerase repliziert den Matrizenstrang, wobei es den Primer als Startpunkt oder Vorlage zum Kopieren verwendet. Als Ergebnis des ersten Zyklus erhalten wir eine wiederholte, sequenzielle Verdopplung eines bestimmten DNA-Abschnitts. Anschließend wiederholen wir dieses Verfahren. Nach jedem Zyklus erhalten wir den Zielabschnitt in verdoppelter Menge. Nach fünfundzwanzig PCR-Zyklen (also in weniger als zwei Stunden) haben wir den für uns interessierenden DNA-Abschnitt in einer Menge, die 225 Mal die Ausgangsmenge übersteigt (wir haben ihn also etwa 34 Millionen Mal amplifiziert). Tatsächlich bestand unser Eingang aus einer Mischung aus Primern, Matrizen-DNA, dem Enzym DNA-Polymerase und freien Basen A, C, G und T, die Menge des spezifischen Reaktionsprodukts (von den Primern begrenzt) wächst exponentiell, während die Menge von „langen“ DNA-Kopien linear wächst, weshalb in den Reaktionsprodukten die Dominanz liegt.
Amplifikation des gewünschten DNA-Abschnitts: Polymerase-Kettenreaktion
Zu Beginn der Verwendung von PCR bestand das Hauptproblem darin, dass nach jedem Heiz- und Kühlzyklus die DNA-Polymerase zur Reaktionsmischung hinzugefügt werden musste, da sie bei einer Temperatur von 95 °C inaktiviert wurde. Daher musste sie vor jedem der 25 Zyklen erneut hinzugefügt werden. Das Verfahren zur Durchführung der Reaktion war vergleichsweise ineffizient, zeitaufwändig und erforderte viel Polymeraseenzym, was nicht gerade günstig war. Zum Glück kam der Natur zu Hilfe. Viele Tiere fühlen sich bei Temperaturen deutlich über 37 °C wohl. Warum ist die Zahl 37 °C für uns wichtig geworden? Dies liegt daran, dass diese Temperatur optimal für E. coli ist, aus dem ursprünglich das Polymeraseenzym für die PCR gewonnen wurde. In der Natur gibt es Mikroorganismen, deren Proteine sich über Millionen Jahre der natürlichen Selektion gegenüber hohen Temperaturen stabiler entwickelt haben. Es wurde vorgeschlagen, DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien zu verwenden. Diese Enzyme erwiesen sich als thermostabil und waren in der Lage, viele Reaktionszyklen zu überstehen. Ihre Verwendung ermöglichte eine Vereinfachung und Automatisierung der PCR-Durchführung. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus isoliert, das in den heißen Quellen des Yellowstone-Nationalparks vorkommt, und wurde Taq-Polymerase genannt.
Die PCR entwickelte sich schnell zur Hauptarbeitsgrundlage des Projekts "Humangenom". Im Grunde unterscheidet sich der Prozess nicht von dem, der von Mullis entwickelt wurde, er wurde lediglich automatisiert. Wir waren nicht mehr auf eine Gruppe leicht sehbehinderter Doktoranden angewiesen, die akribisch Tropfen von Flüssigkeit in Plastikröhrchen umschütten. In modernen Laboren, die molekulargenetische Forschungen durchführen, wird diese Arbeit von robotisierten Förderbändern erledigt. Die PCR-Roboter, die in großem Umfang an einem Projekt wie dem "Humangenom" beteiligt sind, arbeiten unermüdlich mit großen Mengen an hitzestabiler Polymerase. Einige Wissenschaftler, die am Projekt "Humangenom" mitarbeiten, waren über die unangemessen hohen Gebühren empört, die der Inhaber des Patents für die PCR, der europäische Industrie-Pharma-Gigant Hoffmann-LaRoche, zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien hinzufügt.
Ein weiteres „bewegendes Prinzip“ war die Sequenzierungsmethode von DNA. Die chemische Grundlage dieser Methode war zu jener Zeit bereits keine Neuheit mehr: Das zwischenstaatliche Projekt „Humangenom“ (HGP) hatte dieselbe raffinierte Methode übernommen, die Fred Sanger bereits in den Mitte der 1970er Jahre entwickelt hatte. Die Innovation lag jedoch im Umfang und im Grad der Automatisierung, die bei der Sequenzierung erreicht wurden.
Die automatische Sequenzierung wurde ursprünglich im Labor von Lee Hood am California Institute of Technology entwickelt. Er beendete die Schule im Bundesstaat Montana und spielte American Football in der Position des Angreifers; dank Hood gewann das Team mehrmals die Staatsmeisterschaft. Die Fähigkeiten zur Teamarbeit kamen ihm auch in seiner wissenschaftlichen Karriere zugute. In Hoods Labor arbeitete eine bunte Gruppe von Chemikern, Biologen und Ingenieuren, und bald wurde sein Labor führend in technologischen Innovationen.
Tatsächlich wurden die Methode der automatischen Sequenzierung von Lloyd Smith und Mike Hunkapiller erfunden. Mike Hunkapiller, der damals im Labor von Hood arbeitete, wandte sich an Lloyd Smith und schlug ihm ein verbessertes Sequenzierungsverfahren vor, bei dem die Basen jedes Typs in einer eigenen Farbe gefärbt würden. Eine solche Idee könnte die Effizienz des Sanger-Verfahrens um das Vierfache steigern. Bei Sanger, der beim Sequenzieren in jedem der vier Röhrchen (entsprechend der Anzahl der Basen) unter Verwendung von DNA-Polymerase einen einzigartigen Satz von Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge bildet, einschließlich der Primersequenz. Anschließend wurde Formamid zu den Röhrchen gegeben, um die Stränge zu entfalten, und es wurde Gelelektrophorese in einem Polyacrylamidgel in vier Bahnen durchgeführt. In der Variante von Smith und Hunkapiller werden Dideoxynukleotide mit vier verschiedenen Farbstoffen markiert und die PCR in einem Röhrchen durchgeführt. Während der Gelelektrophorese wirkt ein Laserstrahl an einer bestimmten Stelle des Gels, um die Aktivität der Farbstoffe zu aktivieren, und der Detektor bestimmt, welches Nukleotid gerade durch das Gel migriert. Zunächst war Smith pessimistisch eingestellt – er befürchtete, dass die Verwendung von ultrakleinen Farbstoffmengen dazu führen würde, dass die nukleotidischen Abschnitte nicht unterscheidbar wären. Doch da er sich hervorragend mit Lasertechnologien auskannte, fand er bald eine Lösung, indem er spezielle Fluoreszenzfarbstoffe verwendete, die unter dem Einfluss von Laserstrahlung fluoreszieren.
(Vollversion – 4,08 MB) Kleingedruckt: die DNA-Sequenz, die mit einem automatischen Sequenzierer entschlüsselt wurde, stammt aus einem Gerät zur automatischen Sequenzierung. Jeder Farbe entspricht eine der vier Basen
Im klassischen Ansatz der Sanger-Methode dient einer der Stränge der untersuchten DNA als Matrize für die Synthese des komplementären Strangs durch das Enzym DNA-Polymerase. Anschließend werden die DNA-Fragmente in einem Gel nach Größe sortiert. Jedes Fragment, das während der Synthese in die DNA aufgenommen wird und die Visualisierung der Reaktionsprodukte ermöglicht, wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der dem terminalen Nukleotid entspricht (darüber wurde auf S. 124 gesprochen); daher wird die Fluoreszenz dieses Fragmentes als Identifikator für dieses Nukleotid verwendet. Danach bleibt nur noch, die Produkte der Reaktion zu detektieren und zu visualisieren. Die Ergebnisse werden mithilfe eines Computers analysiert und in Form einer Sequenz verschiedenfarbiger Spitzen dargestellt, die den vier Nukleotiden entsprechen. Anschließend wird die Information direkt in das Informationssystem des Computers übertragen, was den zeitaufwendigen und oft mühsamen Prozess der Dateneingabe ausschließt, der das Sequenzieren erheblich erschwerte.
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Quelle: habr.com
