Der amerikanische Chemie-Nobelpreisträger Kary Mullis ist im Alter von 74 Jahren in Kalifornien gestorben. Nach Angaben seiner Frau ereignete sich der Tod am 7. August. Die Ursache ist Herz- und Atemversagen aufgrund einer Lungenentzündung.
James Watson selbst, der Entdecker des DNA-Moleküls, wird uns von seinem Beitrag zur Biochemie erzählen, für den er den Nobelpreis erhielt.
Auszug aus dem Buch von James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Geschichte der genetischen Revolution
Kapitel 7. Menschliches Genom. Lebensszenario
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde 1983 vom Biochemiker Carey Mullis erfunden, der bei Cetus arbeitete. Die Entdeckung dieser Reaktion war ziemlich bemerkenswert. Mullis erinnerte sich später: „An einem Freitagabend im April 1983 hatte ich eine Offenbarung. Ich saß am Steuer und fuhr eine mondbeschienene, kurvenreiche Bergstraße in Nordkalifornien, dem Land der Mammutbäume, entlang.“ Es ist beeindruckend, dass ihn gerade in einer solchen Situation die Inspiration traf. Und es ist nicht so, dass es in Nordkalifornien spezielle Straßen gibt, die die Einsicht fördern; Es ist nur so, dass sein Freund Mullis einmal rücksichtslos über eine vereiste Schnellstraße rasen sah, und das störte ihn überhaupt nicht. Ein Freund erzählte der New York Times: „Mullis hatte eine Vision, dass er sterben würde, indem er gegen einen Mammutbaum prallte. Deshalb hat er beim Autofahren vor nichts Angst, es sei denn, entlang der Straße wachsen Mammutbäume.“ Die Anwesenheit von Mammutbäumen entlang der Straße zwang Mullis, sich zu konzentrieren und ... hier war sie, eine Erkenntnis. Mullis erhielt für seine Erfindung 1993 den Nobelpreis für Chemie und ist seitdem in seinem Handeln noch seltsamer geworden. Er ist beispielsweise ein Befürworter der revisionistischen Theorie, dass AIDS nichts mit HIV zu tun hat, was seinen eigenen Ruf erheblich schädigte und die Arbeit der Ärzte beeinträchtigte.
PCR ist eine ziemlich einfache Reaktion. Dazu benötigen wir zwei chemisch synthetisierte Primer, die zu den gegenüberliegenden Enden verschiedener Stränge des benötigten DNA-Fragments komplementär sind. Primer sind kurze Abschnitte einzelsträngiger DNA mit einer Länge von jeweils etwa 20 Basenpaaren. Die Besonderheit von Primern besteht darin, dass sie den zu amplifizierenden DNA-Abschnitten, also der DNA-Matrize, entsprechen.
(Bild anklickbar) Kary Mullis, Erfinder der PCR
Die Spezifität der PCR basiert auf der Bildung komplementärer Komplexe zwischen der Matrize und Primern, kurzen synthetischen Oligonukleotiden. Jeder Primer ist komplementär zu einem der Stränge der doppelsträngigen Matrize und begrenzt den Anfang und das Ende der amplifizierten Region. Tatsächlich handelt es sich bei der resultierenden „Matrix“ um ein ganzes Genom, und unser Ziel ist es, die für uns interessanten Fragmente daraus zu isolieren. Dazu wird die doppelsträngige DNA-Vorlage mehrere Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um die DNA-Stränge zu trennen. Dieser Schritt wird Denaturierung genannt, da die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA-Strängen aufgebrochen werden. Sobald sich die Stränge getrennt haben, wird die Temperatur gesenkt, damit die Primer an die einzelsträngige Matrize binden können. Die DNA-Polymerase beginnt mit der DNA-Replikation durch Bindung an einen Abschnitt der Nukleotidkette. Das Enzym DNA-Polymerase repliziert den Matrizenstrang mithilfe eines Primers als Primer oder Beispiel zum Kopieren. Als Ergebnis des ersten Zyklus erhalten wir eine mehrfache sequentielle Verdoppelung eines bestimmten DNA-Abschnitts. Als nächstes wiederholen wir diesen Vorgang. Nach jedem Zyklus erhalten wir eine Zielfläche in doppelter Menge. Nach fünfundzwanzig PCR-Zyklen (also in weniger als zwei Stunden) haben wir den für uns interessanten DNA-Bereich in einer Menge, die 225-mal höher ist als das Original (das heißt, wir haben ihn etwa 34 Millionen Mal amplifiziert). Tatsächlich erhielten wir am Eingang eine Mischung aus Primern, Matrizen-DNA, dem DNA-Polymerase-Enzym und den freien Basen A, C, G und T. Die Menge eines spezifischen Reaktionsprodukts (begrenzt durch die Primer) wächst exponentiell und die Anzahl von „langen“ DNA-Kopien ist linear und dominiert daher in Reaktionsprodukten.
Amplifikation des gewünschten DNA-Abschnitts: Polymerase-Kettenreaktion
In den Anfängen der PCR bestand das Hauptproblem darin, dass nach jedem Heiz-Kühl-Zyklus der Reaktionsmischung DNA-Polymerase zugesetzt werden musste, da diese bei einer Temperatur von 95 °C inaktiviert wurde. Daher war es notwendig, es vor jedem der 25 Zyklen erneut hinzuzufügen. Das Reaktionsverfahren war relativ ineffizient, erforderte viel Zeit und das Polymerase-Enzym und das Material war sehr teuer. Zum Glück kam Mutter Natur zur Rettung. Viele Tiere fühlen sich bei Temperaturen weit über 37 °C wohl. Warum wurde die Zahl 37 °C für uns wichtig? Dies geschah, weil diese Temperatur für E. coli optimal ist, aus dem ursprünglich das Polymerase-Enzym für die PCR gewonnen wurde. In der Natur gibt es Mikroorganismen, deren Proteine im Laufe der Jahrmillionen natürlicher Selektion resistenter gegen hohe Temperaturen geworden sind. Es wurde vorgeschlagen, DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien zu verwenden. Diese Enzyme erwiesen sich als thermostabil und überstanden viele Reaktionszyklen. Ihr Einsatz ermöglichte eine Vereinfachung und Automatisierung der PCR. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus isoliert, das in den heißen Quellen des Yellowstone-Nationalparks lebt, und erhielt den Namen Taq-Polymerase.
PCR wurde schnell zum Arbeitstier des Humangenomprojekts. Im Allgemeinen unterscheidet sich der Prozess nicht von dem von Mullis entwickelten, er wurde lediglich automatisiert. Wir waren nicht mehr darauf angewiesen, dass eine Schar dämlicher Doktoranden mühsam Flüssigkeitströpfchen in Plastikreagenzgläser goss. In modernen Laboren, die molekulargenetische Forschung betreiben, werden diese Arbeiten auf Roboterförderern durchgeführt. PCR-Roboter, die an einem so großen Sequenzierungsprojekt wie dem menschlichen Genom beteiligt sind, arbeiten unermüdlich mit riesigen Mengen hitzestabiler Polymerase. Einige Wissenschaftler, die am Humangenomprojekt arbeiten, waren empört über die unangemessen hohen Lizenzgebühren, die der Inhaber des PCR-Patents, der europäische Industriepharmariese Hoffmann-LaRoche, zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien hinzufügte.
Ein weiteres „treibendes Prinzip“ war die DNA-Sequenzierungsmethode selbst. Die chemische Grundlage dieser Methode war damals nicht mehr neu: Das Interstate Human Genome Project (HGP) übernahm die gleiche geniale Methode, die Fred Sanger bereits Mitte der 1970er Jahre entwickelt hatte. Die Innovation lag im Umfang und Grad der Automatisierung, die durch die Sequenzierung erreicht werden konnte.
Die automatisierte Sequenzierung wurde ursprünglich im Labor von Lee Hood am California Institute of Technology entwickelt. Er besuchte die High School in Montana und spielte als Quarterback College-Football; Dank Hood gewann das Team mehr als einmal die Staatsmeisterschaft. Auch seine Teamfähigkeit kam ihm in seiner wissenschaftlichen Laufbahn zugute. Hoods Labor bestand aus einer bunt zusammengewürfelten Truppe aus Chemikern, Biologen und Ingenieuren, und sein Labor entwickelte sich bald zu einem führenden Unternehmen für technologische Innovationen.
Tatsächlich wurde die automatisierte Sequenzierungsmethode von Lloyd Smith und Mike Hunkapiller erfunden. Mike Hunkapiller, der damals in Hoods Labor arbeitete, wandte sich an Lloyd Smith mit einem Vorschlag für eine verbesserte Sequenzierungsmethode, bei der jeder Basentyp anders gefärbt wäre. Eine solche Idee könnte die Effizienz des Sanger-Prozesses vervierfachen. In Sanger wird bei der Sequenzierung in jedem der vier Röhrchen (entsprechend der Anzahl der Basen) unter Beteiligung der DNA-Polymerase ein einzigartiger Satz von Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge gebildet, einschließlich einer Primersequenz. Anschließend wurde Formamid zur Kettentrennung in die Röhrchen gegeben und auf vier Bahnen eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. In der Version von Smith und Hunkapiller werden Didesoxynukleotide mit vier verschiedenen Farbstoffen markiert und die PCR wird in einem Röhrchen durchgeführt. Bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese regt dann ein Laserstrahl an einer bestimmten Stelle des Gels die Aktivität der Farbstoffe an und der Detektor ermittelt, welches Nukleotid gerade durch das Gel wandert. Zunächst war Smith pessimistisch – er befürchtete, dass die Verwendung extrem niedriger Farbstoffdosen dazu führen würde, dass die Nukleotidregionen nicht mehr zu unterscheiden seien. Da er sich jedoch hervorragend mit der Lasertechnologie auskannte, fand er bald einen Ausweg, indem er spezielle Fluorochrom-Farbstoffe verwendete, die bei Einwirkung von Laserstrahlung fluoreszieren.
(Vollversion - 4,08 MB) Kleingedrucktes: Mit einem automatischen Sequenzierer sequenzierte DNA-Sequenz, erhalten von einer automatischen Sequenziermaschine. Jede Farbe entspricht einer von vier Basen
Bei der klassischen Version der Sanger-Methode dient einer der Stränge der analysierten DNA als Vorlage für die Synthese eines komplementären Strangs durch das Enzym DNA-Polymerase, anschließend wird die Sequenz der DNA-Fragmente in einem Gel nach Größe sortiert. Jedes Fragment, das während der Synthese in die DNA einbezogen wird und die anschließende Visualisierung von Reaktionsprodukten ermöglicht, wird mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, der der terminalen Base entspricht (dies wurde auf S. 124 besprochen); Daher ist die Fluoreszenz dieses Fragments ein Identifikator für eine bestimmte Base. Dann müssen nur noch die Detektion und die Visualisierung der Reaktionsprodukte durchgeführt werden. Die Ergebnisse werden per Computer analysiert und als Folge mehrfarbiger Peaks dargestellt, die vier Nukleotiden entsprechen. Die Informationen werden dann direkt an das Informationssystem des Computers übertragen, wodurch der zeitaufwändige und manchmal schmerzhafte Dateneingabeprozess entfällt, der die Sequenzierung sehr schwierig machte.
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Source: habr.com