{"id":37174,"date":"2019-10-31T22:16:11","date_gmt":"2019-10-31T19:16:11","guid":{"rendered":"https:\/\/prohoster.info\/blog\/umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk\/"},"modified":"2019-10-31T22:16:11","modified_gmt":"2019-10-31T19:16:11","slug":"umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/prohoster.info\/de\/blog\/novosti-interneta\/umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk","title":{"rendered":"Der Nobelpreistr\u00e4ger Kary Mullis ist verstorben \u2013 Erfinder der Polymerase-Kettenreaktion.","gt_translate_keys":[{"key":"rendered","format":"text"}]},"content":{"rendered":"

\"Der In Kalifornien ist der amerikanische Nobelpreistr\u00e4ger f\u00fcr Chemie Kary Mullis im Alter von 74 Jahren gestorben. Laut seiner Ehefrau verstarb er am 7. August. Die Todesursache war Herz- und Atemversagen aufgrund von Pneumonie.<\/p>\n

Was seinen Beitrag zur Biochemie und den Grund f\u00fcr den Erhalt des Nobelpreises betrifft, wird uns James Watson \u2013 der Entdecker der DNA-Molek\u00fcle \u2013 berichten. <\/p>\n

Ein Auszug aus dem Buch von James Watson, Andrew Berry, Kevin Davies. <\/p>\n

DNA. Die Geschichte der genetischen Revolution.<\/h2>\n

Kapitel 7. Das menschliche Genom. Lebensszenario.<\/h3>\n

\n<\/a><\/noindex>
\n\u2026
\nDie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde 1983 von dem Biochemiker Kary Mullis, der bei der Firma Cetus arbeitete, erfunden. Die Entdeckung dieser Reaktion war bemerkenswert. Sp\u00e4ter erinnerte sich Mullis: \"Eines Freitagnachts im April 1983 wurde ich pl\u00f6tzlich erleuchtet. Ich fuhr, w\u00e4hrend ich die kurvenreiche Bergstra\u00dfe im von Mondlicht erhellten Nordkalifornien entlangrollte, wo sich die Mammutbaumw\u00e4lder befinden.\" Es ist beeindruckend, dass ihn in einem solchen Moment die Inspiration \u00fcberkam. Und es liegt nicht daran, dass die Stra\u00dfen im Nordkalifornien besonders erscheinen, die solche Erleuchtungen f\u00f6rdern; viel mehr ist es so, dass ein Freund einmal gesehen hatte, wie Mullis r\u00fccksichtslos auf einer vereisten Stra\u00dfe mit Gegenverkehr fuhr, und das st\u00f6rte ihn \u00fcberhaupt nicht. Der Freund berichtete der New York Times Folgendes: \"Mullis tr\u00e4umte, dass er sterben w\u00fcrde, als er gegen einen Mammutbaum prallte. Deshalb hat er beim Fahren keine Angst, solange keine Mammutb\u00e4ume am Stra\u00dfenrand wachsen.\" Das Vorhandensein von Mammutb\u00e4umen entlang der Stra\u00dfe lie\u00df Mullis konzentriert bleiben und... da war es, die Erleuchtung. F\u00fcr seine Erfindung erhielt Mullis 1993 den Nobelpreis f\u00fcr Chemie und seitdem wurde er in seinen Handlungen noch merkw\u00fcrdiger. Zum Beispiel ist er ein Bef\u00fcrworter der revisionistischen Theorie, dass AIDS nicht mit HIV in Verbindung steht, was seinen eigenen Ruf erheblich gesch\u00e4digt hat und die \u00c4rzte behindert hat.<\/p>\n

PCR ist eine relativ einfache Reaktion. F\u00fcr ihre Durchf\u00fchrung ben\u00f6tigen wir zwei chemisch synthetisierte Primer, die komplement\u00e4r zu den entgegengesetzten Enden verschiedener Str\u00e4nge des gew\u00fcnschten DNA-Fragments sind. Primer sind kurze Abschnitte einzelstr\u00e4ngiger DNA, jeder etwa 20 Basenpaare lang. Die Besonderheit der Primer besteht darin, dass sie den DNA-Abschnitten entsprechen, die amplifiziert werden sollen, also der DNA-Matrix. <\/p>\n

\"Der<\/a><\/noindex>
\n(Das Bild ist klickbar) Kary Mullis, Erfinder der PCR<\/i><\/p>\n

Die Spezifit\u00e4t der PCR basiert auf der Bildung komplement\u00e4rer Komplexe zwischen der Matrize und den Primern, kurzen synthetischen Oligonukleotiden. Jeder Primer ist komplement\u00e4r zu einem der Str\u00e4nge der doppelstr\u00e4ngigen Matrize und definiert den Beginn und das Ende des amplifizierbaren Abschnitts. Tats\u00e4chlich stellt die erhaltene \"Matrize\" das vollst\u00e4ndige Genom dar, und unser Ziel ist es, die f\u00fcr uns interessanten Fragmente daraus zu isolieren. Zu diesem Zweck wird die doppelstr\u00e4ngige DNA-Matrize f\u00fcr einige Minuten auf 95 \u00b0C erhitzt, sodass sich die DNA-Str\u00e4nge trennen. Diese Phase wird als Denaturierung bezeichnet, da die Wasserstoffbr\u00fcckenbindungen zwischen den beiden DNA-Str\u00e4ngen zerbrochen werden. Wenn sich die Str\u00e4nge getrennt haben, wird die Temperatur gesenkt, damit die Primer sich mit der einzelstr\u00e4ngigen Matrize verbinden k\u00f6nnen. Die DNA-Polymerase beginnt mit der DNA-Replikation, indem sie sich an ein Segment der Nukleotidkette anlagert. Das Enzym DNA-Polymerase repliziert den Matrizenstrang und verwendet den Primer als Ausgangspunkt oder Vorlage f\u00fcr die Kopie. Im Ergebnis des ersten Zyklus erhalten wir eine mehrfache, aufeinanderfolgende Verdopplung eines bestimmten DNA-Abschnitts. Danach wiederholen wir dieses Verfahren. Nach jedem Zyklus erhalten wir das Zielgebiet in doppelter Menge. Nach f\u00fcnfundzwanzig PCR-Zyklen (also in weniger als zwei Stunden) haben wir den interessierenden DNA-Abschnitt in einer Menge, die das Ausgangsmaterial um das 225-fache \u00fcbersteigt (wir haben ihn also etwa 34 Millionen Mal amplifiziert). Tats\u00e4chlich hatten wir zu Beginn eine Mischung aus Primern, Matrizen-DNA, dem Enzym DNA-Polymerase und freien Basen A, C, G und T, wobei die Menge des spezifischen Reaktionsprodukts (begrenzte Primer) exponentiell w\u00e4chst, w\u00e4hrend die Anzahl der \"langen\" DNA-Kopien linear w\u00e4chst, sodass in den Reaktionsprodukten die Dominanz besteht.<\/p>\n

\"Der
\nAmplifikation des ben\u00f6tigten DNA-Areals: Polymerase-Kettenreaktion<\/i><\/p>\n

In den fr\u00fchen Tagen der PCR gab es ein grundlegendes Problem: Nach jedem Zyklus von Erw\u00e4rmen und Abk\u00fchlen musste DNA-Polymerase zur Reaktion hinzugef\u00fcgt werden, da sie bei 95 \u00b0C inaktiv wurde. Daher musste sie vor jedem der 25 Zyklen erneut hinzugef\u00fcgt werden. Das Verfahren zur Durchf\u00fchrung der Reaktion war vergleichsweise ineffizient, zeitaufw\u00e4ndig und ben\u00f6tigte eine Menge Polymerase, die relativ teuer ist. Gl\u00fccklicherweise kam die Natur zur Hilfe. Viele Tiere f\u00fchlen sich bei Temperaturen weit \u00fcber 37 \u00b0C wohl. Aber warum ist f\u00fcr uns die Zahl 37 \u00b0C so wichtig? Das liegt daran, dass diese Temperatur optimal f\u00fcr E. coli ist, aus der das Enzym Polymerase f\u00fcr die PCR urspr\u00fcnglich gewonnen wurde. In der Natur gibt es Mikroorganismen, deren Proteine durch Millionen Jahre nat\u00fcrliche Selektion hitzebest\u00e4ndiger geworden sind. Es wurde vorgeschlagen, DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien zu verwenden. Diese Enzyme erwiesen sich als thermostabil und waren in der Lage, viele Reaktionszyklen zu \u00fcberstehen. Ihr Einsatz erm\u00f6glichte die Vereinfachung und Automatisierung der PCR. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus isoliert, das in den hei\u00dfen Quellen des Yellowstone-Nationalparks vorkommt, und erhielt den Namen Taq-Polymerase.<\/p>\n

Die PCR hat sich schnell zur Hauptarbeitspferd des Projekts \"Humangenom\" entwickelt. Im Grunde unterscheidet sich der Prozess nicht von dem, was Mullis entwickelt hat, er wurde lediglich automatisiert. Wir waren nicht mehr von einer Gruppe halbblinder Doktoranden abh\u00e4ngig, die m\u00fchsam Tropfen Fl\u00fcssigkeit in Plastikrohren umf\u00fcllten. In modernen Laboren, die molekulargenetische Untersuchungen durchf\u00fchren, wird diese Arbeit auf robotergest\u00fctzten F\u00f6rderb\u00e4ndern erledigt. Die PCR-Roboter, die in einem so umfassenden Projekt wie dem \"Humangenom\" aktiv sind, arbeiten unerm\u00fcdlich mit riesigen Mengen an thermoresistenter Polymerase. Einige Wissenschaftler, die an dem Projekt \"Humangenom\" beteiligt sind, waren emp\u00f6rt \u00fcber die unangemessen hohen Abgaben, die der Patentinhaber der PCR, der europ\u00e4ische Industrie-Pharmagigant Hoffmann-LaRoche, zu den Kosten der Verbrauchsmaterialien hinzuf\u00fcgt.<\/p>\n

Ein weiterer \"motorischer Antrieb\" war die Sequenzierungsmethode selbst. Die chemische Basis dieser Methode war zu diesem Zeitpunkt bereits nicht neu: Das interstaatliche Projekt \"Human Genome Project\" (HGP) \u00fcbernahm dieselbe raffinierte Methode, die Fred Sanger bereits in den 1970er Jahren entwickelt hatte. Die Innovation lag jedoch im Umfang und in dem Automatisierungsgrad, die bei der Sequenzierung erreicht wurden.<\/p>\n

Die automatische Sequenzierung wurde urspr\u00fcnglich im Labor von Lee Hood am California Institute of Technology entwickelt. Er schloss die Schule im Bundesstaat Montana ab und spielte American Football als Offensive Player; dank Hood gewann das Team mehrmals die Meisterschaft des Bundesstaates. Seine Teamf\u00e4higkeit kam ihm auch in seiner wissenschaftlichen Karriere zugute. Im Labor von Hood arbeitete eine bunte Mischung aus Chemikern, Biologen und Ingenieuren, und bald wurde sein Labor f\u00fchrend in technologischen Innovationen.<\/p>\n

Tats\u00e4chlich wurden die Methoden zur automatischen Sequenzierung von Lloyd Smith und Mike Hunkapiller erfunden. Mike Hunkapiller, der damals im Hud-Labor arbeitete, wandte sich an Lloyd Smith und schlug ihm eine verbesserte Sequenzierungsmethode vor, bei der die Basen jedes Typs in verschiedenen Farben gef\u00e4rbt werden. Diese Idee hatte das Potenzial, die Effizienz des Sanger-Prozesses um das Vierfache zu steigern. Bei Sanger entsteht beim Sequenzieren in jedem der vier Gef\u00e4\u00dfe (entsprechend der Anzahl der Basen) ein einzigartiges Set von Oligonukleotiden unterschiedlicher L\u00e4nge, das die Primersequenz enth\u00e4lt, unter Mitwirkung der DNA-Polymerase. Anschlie\u00dfend wurde Formamid zu den Proben gegeben, um die Str\u00e4nge zu trennen und es wurde Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel auf vier Bahnen durchgef\u00fchrt. In der Variante von Smith und Hunkapiller wurden Dideoxynukleotide mit vier verschiedenen Farbstoffen markiert und die PCR in einem einzigen Gef\u00e4\u00df durchgef\u00fchrt. W\u00e4hrend der Elektrophorese im Polyacrylamidgel aktiviert ein Laserstrahl an einem bestimmten Punkt des Gels die Aktivit\u00e4t der Farbstoffe, und der Detektor bestimmt, welche Nukleotid gerade durch das Gel wandert. Zun\u00e4chst war Smith skeptisch und bef\u00fcrchtete, dass die Verwendung von extrem geringen Farbstoffdosen dazu f\u00fchren w\u00fcrde, dass die Nukleotidabschnitte nicht erkennbar sind. Doch da er hervorragende Kenntnisse in Lasertechnologien besa\u00df, fand er bald eine L\u00f6sung, indem er spezielle fluoreszierende Farbstoffe einsetzte, die unter Laserbestrahlung fluoreszieren.<\/p>\n

\"Der
\n(Vollversion bei Klick<\/a><\/noindex> \u2014 4,08 MB) Klein geschrieben: Die DNA-Sequenz, die mit einem automatischen Sequenzierer entschl\u00fcsselt wurde, stammt von einem Ger\u00e4t zur automatischen Sequenzierung. Jeder Farbe entspricht eine der vier Basen.<\/i> <\/p>\n

Im klassischen Ansatz der Sanger-Methode dient eine der analysierten DNA-Str\u00e4nge als Matrize f\u00fcr die Synthese der komplement\u00e4ren Str\u00e4nge durch die DNA-Polymerase. Anschlie\u00dfend werden die DNA-Fragmente im Gel nach Gr\u00f6\u00dfe sortiert. Jeder fragmentierte Teil, der w\u00e4hrend der Synthese in die DNA integriert wird und die Visualisierung der Reaktionsprodukte erm\u00f6glicht, wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der dem terminalen Basenpaar entspricht (dazu siehe S. 124); die Fluoreszenz dieses Fragmentes fungiert somit als Identifikator f\u00fcr die jeweilige Base. Danach bleibt nur noch, die Produkte der Reaktion zu detektieren und zu visualisieren. Die Ergebnisse werden mithilfe eines Computers analysiert und in Form einer Sequenz farbiger Spitzen dargestellt, die den vier Nukleotiden entsprechen. Die Informationen werden direkt in das Informationssystem des Computers \u00fcbertragen, was den zeitaufw\u00e4ndigen und oft m\u00fchsamen Prozess der Dateneingabe ausschlie\u00dft, der das Sequenzieren erheblich erschwerte.<\/p>\n

\u00bb Weitere Informationen zu dem Buch finden Sie auf der Verlagswebsite<\/a><\/noindex>
\n\u00bb Inhaltsverzeichnis<\/a><\/noindex>
\n\u00bb Auszug<\/a><\/noindex><\/p>\n

F\u00fcr Habr-Besucher gilt ein Rabatt von 25 % mit dem Code \u2014 PCR<\/b>
\n
Quelle: habr.com<\/a><\/p>","protected":false,"gt_translate_keys":[{"key":"rendered","format":"html"}]},"excerpt":{"rendered":"

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