Πέθανε στην Καλιφόρνια σε ηλικία 74 ετών ο Αμερικανός νομπελίστας Χημείας Κάρυ Μάλις. Σύμφωνα με τη σύζυγό του, ο θάνατος σημειώθηκε στις 7 Αυγούστου. Η αιτία είναι η καρδιακή και αναπνευστική ανεπάρκεια λόγω πνευμονίας.
Ο ίδιος ο Τζέιμς Γουάτσον, ο ανακάλυψε το μόριο του DNA, θα μας μιλήσει για τη συμβολή του στη βιοχημεία και για την οποία έλαβε το βραβείο Νόμπελ.
Απόσπασμα από το βιβλίο των James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Ιστορία της Γενετικής Επανάστασης
Κεφάλαιο 7. Ανθρώπινο γονιδίωμα. Σενάριο ζωής
...
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) επινοήθηκε το 1983 από τον βιοχημικό Carey Mullis, ο οποίος εργαζόταν στην Cetus. Η ανακάλυψη αυτής της αντίδρασης ήταν αρκετά αξιοσημείωτη. Ο Μάλις θυμήθηκε αργότερα: «Μια Παρασκευή βράδυ τον Απρίλιο του 1983, είχα μια Θεοφάνεια. Ήμουν πίσω από το τιμόνι, οδηγώντας σε έναν φεγγαρόφωτο, ελικοειδή ορεινό δρόμο στη Βόρεια Καλιφόρνια, τη χώρα των δασών του κόκκινου ξύλου». Είναι εντυπωσιακό ότι σε μια τέτοια κατάσταση τον χτύπησε η έμπνευση. Και δεν είναι ότι η βόρεια Καλιφόρνια έχει ειδικούς δρόμους που προωθούν τη διορατικότητα. απλά ο φίλος του είδε κάποτε τον Mullis να τρέχει απερίσκεπτα σε ένα παγωμένο διπλό οδόστρωμα και δεν τον ενόχλησε καθόλου. Ένας φίλος είπε στους New York Times: «Ο Mullis είχε ένα όραμα ότι θα πέθαινε πέφτοντας σε ένα δέντρο redwood. Ως εκ τούτου, δεν φοβάται τίποτα κατά την οδήγηση, εκτός και αν φυτρώνουν κόκκινα δέντρα κατά μήκος του δρόμου». Η παρουσία κόκκινων ξύλων κατά μήκος του δρόμου ανάγκασε τον Mullis να συγκεντρωθεί και... ορίστε, μια διορατικότητα. Ο Mullis έλαβε το Νόμπελ Χημείας για την εφεύρεσή του το 1993 και έκτοτε έγινε ακόμη πιο περίεργος στις πράξεις του. Για παράδειγμα, είναι υποστηρικτής της ρεβιζιονιστικής θεωρίας ότι το AIDS δεν σχετίζεται με τον ιό HIV, κάτι που υπονόμευσε σημαντικά τη δική του φήμη και παρενέβη στους γιατρούς.
Η PCR είναι μια αρκετά απλή αντίδραση. Για να το πραγματοποιήσουμε, χρειαζόμαστε δύο χημικά συντιθέμενους εκκινητές που είναι συμπληρωματικοί στα αντίθετα άκρα διαφορετικών κλώνων του απαιτούμενου θραύσματος DNA. Οι εκκινητές είναι μικρά τμήματα μονόκλωνου DNA, με μήκος περίπου 20 ζεύγη βάσεων το καθένα. Η ιδιαιτερότητα των εκκινητών είναι ότι αντιστοιχούν στα τμήματα DNA που πρέπει να ενισχυθούν, δηλαδή στο εκμαγείο DNA.
(Εικόνα με δυνατότητα κλικ) Kary Mullis, εφευρέτης της PCR
Η ειδικότητα της PCR βασίζεται στον σχηματισμό συμπληρωματικών συμπλεγμάτων μεταξύ του εκμαγείου και των εκκινητών, βραχέων συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων. Κάθε εκκινητής είναι συμπληρωματικός σε έναν από τους κλώνους του δίκλωνου προτύπου και περιορίζει την αρχή και το τέλος της ενισχυμένης περιοχής. Στην πραγματικότητα, η «μήτρα» που προκύπτει είναι ένα ολόκληρο γονιδίωμα και στόχος μας είναι να απομονώσουμε τα θραύσματα που μας ενδιαφέρουν από αυτό. Για να γίνει αυτό, το εκμαγείο δίκλωνου DNA θερμαίνεται στους 95 °C για αρκετά λεπτά για να διαχωριστούν οι κλώνοι του DNA. Αυτό το στάδιο ονομάζεται μετουσίωση επειδή οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο κλώνων DNA έχουν σπάσει. Μόλις διαχωριστούν οι κλώνοι, η θερμοκρασία μειώνεται για να επιτραπεί στους εκκινητές να συνδεθούν με το μονόκλωνο εκμαγείο. Η DNA πολυμεράση ξεκινά την αντιγραφή του DNA δεσμεύοντας σε ένα τμήμα νουκλεοτιδικής αλυσίδας. Το ένζυμο πολυμεράση DNA αντιγράφει τον κλώνο του εκμαγείου χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή ως εκκινητή ή παράδειγμα για αντιγραφή. Ως αποτέλεσμα του πρώτου κύκλου, λαμβάνουμε πολλαπλό διαδοχικό διπλασιασμό ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA. Στη συνέχεια επαναλαμβάνουμε αυτή τη διαδικασία. Μετά από κάθε κύκλο παίρνουμε μια περιοχή στόχο σε διπλή ποσότητα. Μετά από είκοσι πέντε κύκλους PCR (δηλαδή σε λιγότερο από δύο ώρες), έχουμε την περιοχή DNA που μας ενδιαφέρει σε ποσότητα 225 φορές μεγαλύτερη από την αρχική (δηλαδή την έχουμε ενισχύσει περίπου 34 εκατομμύρια φορές). Πράγματι, στην είσοδο λάβαμε ένα μείγμα εκκινητών, DNA προτύπου, το ένζυμο πολυμεράσης DNA και ελεύθερων βάσεων A, C, G και T, η ποσότητα ενός συγκεκριμένου προϊόντος αντίδρασης (περιορισμένη από τους εκκινητές) αυξάνεται εκθετικά και ο αριθμός των «μακριών» αντιγράφων DNA είναι γραμμικό, επομένως στην αντίδραση κυριαρχούν τα προϊόντα.
Ενίσχυση του επιθυμητού τμήματος DNA: αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Στις πρώτες ημέρες της PCR, το κύριο πρόβλημα ήταν το εξής: μετά από κάθε κύκλο θέρμανσης-ψύξης, έπρεπε να προστεθεί DNA πολυμεράση στο μείγμα της αντίδρασης, καθώς απενεργοποιήθηκε σε θερμοκρασία 95 °C. Επομένως, ήταν απαραίτητο να το προσθέσετε ξανά πριν από κάθε έναν από τους 25 κύκλους. Η διαδικασία αντίδρασης ήταν σχετικά αναποτελεσματική, απαιτούσε πολύ χρόνο και το ένζυμο πολυμεράση και το υλικό ήταν πολύ ακριβό. Ευτυχώς, η Μητέρα Φύση ήρθε στη διάσωση. Πολλά ζώα αισθάνονται άνετα σε θερμοκρασίες πολύ υψηλότερες από 37 °C. Γιατί ο αριθμός 37 °C έγινε σημαντικός για εμάς; Αυτό συνέβη επειδή αυτή η θερμοκρασία είναι η βέλτιστη για το E. coli, από το οποίο ελήφθη αρχικά το ένζυμο πολυμεράσης για PCR. Στη φύση υπάρχουν μικροοργανισμοί των οποίων οι πρωτεΐνες, μετά από εκατομμύρια χρόνια φυσικής επιλογής, έχουν γίνει πιο ανθεκτικές στις υψηλές θερμοκρασίες. Έχει προταθεί η χρήση DNA πολυμερασών από θερμόφιλα βακτήρια. Αυτά τα ένζυμα αποδείχθηκε ότι ήταν θερμοσταθερά και ήταν σε θέση να αντέξουν πολλούς κύκλους αντίδρασης. Η χρήση τους κατέστησε δυνατή την απλοποίηση και την αυτοματοποίηση της PCR. Μία από τις πρώτες θερμοσταθερές πολυμεράσες DNA απομονώθηκε από το βακτήριο Thermus aquaticus, το οποίο ζει στις θερμές πηγές του Εθνικού Πάρκου Yellowstone, και ονομάστηκε Taq polymerase.
Η PCR έγινε γρήγορα ο άξονας εργασίας του Έργου Ανθρώπινου Γονιδιώματος. Γενικά, η διαδικασία δεν διαφέρει από αυτή που ανέπτυξε η Mullis, μόλις αυτοματοποιήθηκε. Δεν ήμασταν πια εξαρτημένοι από ένα πλήθος μισαλλόδοξων μεταπτυχιακών φοιτητών που έριχναν με κόπο σταγονίδια υγρού σε πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες. Σε σύγχρονα εργαστήρια που διεξάγουν μοριακή γενετική έρευνα, αυτή η εργασία εκτελείται σε ρομποτικούς μεταφορείς. Τα ρομπότ PCR που συμμετέχουν σε ένα έργο προσδιορισμού αλληλουχίας τόσο μεγάλο όσο το ανθρώπινο γονιδίωμα εργάζονται ακατάπαυστα με τεράστιους όγκους θερμοσταθερής πολυμεράσης. Ορισμένοι επιστήμονες που εργάζονται στο Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος εξοργίστηκαν από τα αδικαιολόγητα υψηλά δικαιώματα που προστέθηκαν στο κόστος των αναλώσιμων από τον ιδιοκτήτη του διπλώματος ευρεσιτεχνίας PCR, τον ευρωπαϊκό βιομηχανικό φαρμακευτικό κολοσσό Hoffmann-LaRoche.
Μια άλλη «οδηγητική αρχή» ήταν η ίδια η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Η χημική βάση αυτής της μεθόδου δεν ήταν πλέον νέα εκείνη την εποχή: το Διακρατικό Έργο Ανθρώπινου Γονιδιώματος (HGP) υιοθέτησε την ίδια έξυπνη μέθοδο που είχε αναπτύξει ο Φρεντ Σάνγκερ στα μέσα της δεκαετίας του 1970. Η καινοτομία έγκειται στην κλίμακα και τον βαθμό αυτοματοποίησης που μπόρεσε να επιτύχει η αλληλουχία.
Η αυτοματοποιημένη αλληλουχία αναπτύχθηκε αρχικά στο εργαστήριο του Lee Hood στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Καλιφόρνια. Παρακολούθησε το γυμνάσιο στη Μοντάνα και έπαιξε κολεγιακό ποδόσφαιρο ως στρατηγός. Χάρη στον Hood, η ομάδα κέρδισε το κρατικό πρωτάθλημα περισσότερες από μία φορές. Οι δεξιότητές του στην ομαδική εργασία ήταν επίσης χρήσιμες στην επιστημονική του καριέρα. Το εργαστήριο του Hood στελεχώθηκε από ένα ετερόκλητο πλήρωμα χημικών, βιολόγων και μηχανικών και το εργαστήριό του έγινε σύντομα ηγέτης στην τεχνολογική καινοτομία.
Στην πραγματικότητα, η μέθοδος αυτοματοποιημένης αλληλουχίας επινοήθηκε από τους Lloyd Smith και Mike Hunkapiller. Ο Mike Hunkapiller, που εργαζόταν τότε στο εργαστήριο του Hood, πλησίασε τον Lloyd Smith με μια πρόταση για μια βελτιωμένη μέθοδο αλληλουχίας στην οποία κάθε τύπος βάσης θα χρωματιζόταν διαφορετικά. Μια τέτοια ιδέα θα μπορούσε να τετραπλασιάσει την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας Sanger. Στο Sanger, κατά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας σε καθέναν από τους τέσσερις σωλήνες (ανάλογα με τον αριθμό των βάσεων), με τη συμμετοχή της DNA πολυμεράσης, σχηματίζεται ένα μοναδικό σύνολο ολιγονουκλεοτιδίων διαφορετικών μηκών, συμπεριλαμβανομένης μιας αλληλουχίας εκκινητών. Στη συνέχεια, προστέθηκε φορμαμίδιο στους σωλήνες για διαχωρισμό της αλυσίδας και πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου σε τέσσερις λωρίδες. Στην έκδοση των Smith και Hunkapiller, τα διδεοξυνουκλεοτίδια επισημαίνονται με τέσσερις διαφορετικές βαφές και η PCR εκτελείται σε ένα σωληνάριο. Στη συνέχεια, κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου, μια δέσμη λέιζερ σε μια συγκεκριμένη θέση στο πήκτωμα διεγείρει τη δραστηριότητα των βαφών και ο ανιχνευτής καθορίζει ποιο νουκλεοτίδιο μεταναστεύει αυτήν τη στιγμή μέσω της γέλης. Στην αρχή, ο Smith ήταν απαισιόδοξος - φοβόταν ότι η χρήση εξαιρετικά χαμηλών δόσεων βαφής θα οδηγούσε στο να μην ξεχωρίζουν οι περιοχές νουκλεοτιδίων. Ωστόσο, έχοντας εξαιρετική κατανόηση της τεχνολογίας των λέιζερ, βρήκε σύντομα μια διέξοδο από την κατάσταση χρησιμοποιώντας ειδικές βαφές φθοριοχρωμάτων που φθορίζουν όταν εκτίθενται σε ακτινοβολία λέιζερ.
(Πλήρη έκδοση - 4,08 MB) Λεπτά γράμματα: αλληλουχία DNA που προσδιορίζεται με χρήση αυτόματου προσδιοριστή αλληλουχίας, που λαμβάνεται από αυτόματη μηχανή προσδιορισμού αλληλουχίας. Κάθε χρώμα αντιστοιχεί σε μία από τις τέσσερις βάσεις
Στην κλασική εκδοχή της μεθόδου Sanger, ένας από τους κλώνους του αναλυόμενου DNA λειτουργεί ως πρότυπο για τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου από το ένζυμο πολυμεράση DNA και, στη συνέχεια, η αλληλουχία των θραυσμάτων DNA ταξινομείται σε γέλη κατά μέγεθος. Κάθε θραύσμα, το οποίο περιλαμβάνεται στο DNA κατά τη διάρκεια της σύνθεσης και επιτρέπει την επακόλουθη οπτικοποίηση των προϊόντων αντίδρασης, επισημαίνεται με μια φθορίζουσα βαφή που αντιστοιχεί στην τερματική βάση (αυτό συζητήθηκε στη σελ. 124). Επομένως, ο φθορισμός αυτού του θραύσματος θα είναι ένα αναγνωριστικό για μια δεδομένη βάση. Τότε το μόνο που μένει είναι να γίνει ανίχνευση και οπτικοποίηση των προϊόντων αντίδρασης. Τα αποτελέσματα αναλύονται με υπολογιστή και παρουσιάζονται ως αλληλουχία πολύχρωμων κορυφών που αντιστοιχούν σε τέσσερα νουκλεοτίδια. Στη συνέχεια, οι πληροφορίες μεταφέρονται απευθείας στο σύστημα πληροφοριών του υπολογιστή, εξαλείφοντας τη χρονοβόρα και μερικές φορές επίπονη διαδικασία εισαγωγής δεδομένων που έκανε πολύ δύσκολη την αλληλουχία.
» Περισσότερες λεπτομέρειες για το βιβλίο μπορείτε να βρείτε στη διεύθυνση
»
»
Για Khabrozhiteley 25% έκπτωση με χρήση κουπονιού - PCR
Πηγή: www.habr.com