Amerika Nobel-premiito pri kemio Kary Mullis mortis en Kalifornio en la aĝo de 74. Laŭ lia edzino, morto okazis la 7-an de aŭgusto. La kaŭzo estas kora kaj spira malsukceso pro pulminflamo.
James Watson mem, la malkovrinto de la DNA-molekulo, rakontos al ni pri sia kontribuo al biokemio kaj pro kiu li ricevis la Nobel-premion.
Eltiraĵo de la libro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Historio de la Genetika Revolucio
Ĉapitro 7. Homa genaro. Viva scenaro
...
La polimera ĉena reago (PCR) estis inventita en 1983 fare de biokemiisto Carey Mullis, kiu laboris ĉe Cetus. La malkovro de ĉi tiu reago estis sufiĉe rimarkinda. Mullis poste memoris: "Unun vendredon vespere en aprilo 1983, mi havis epifanion. Mi estis malantaŭ la stirado, veturi laŭ lunluma, serpentuma montvojo en Norda Kalifornio, la lando de la sekvojaj arbaroj.” Estas impona, ke estis en tia situacio, ke inspiro trafis lin. Kaj ne estas, ke norda Kalifornio havas specialajn vojojn, kiuj antaŭenigas komprenon; estas nur ke lia amiko iam vidis Mullis rapidi malzorge laŭ glacia separvojo kaj ĝi tute ne ĝenis lin. Amiko diris al la New York Times: "Mullis havis vizion, ke li mortos trafante kontraŭ sekvoarbo. Tial, li timas nenion dum veturado, krom se estas sekvojaj arboj kreskantaj laŭ la vojo.” La ĉeesto de sekvojoj laŭ la vojo devigis Mullis koncentriĝi kaj... jen ĝi estis, kompreno. Mullis ricevis la Nobelpremion pri Kemio pro sia invento en 1993 kaj de tiam fariĝis eĉ pli stranga en siaj agoj. Ekzemple, li estas subtenanto de la reviziisma teorio ke aidoso ne rilatas al HIV, kiu signife subfosis lian propran reputacion kaj influis kuracistojn.
PCR estas sufiĉe simpla reago. Por efektivigi ĝin, ni bezonas du kemie sintezitajn enkondukojn, kiuj estas komplementaj al la kontraŭaj finoj de malsamaj fadenoj de la bezonata DNA-fragmento. Enkondukoj estas mallongaj sekcioj de unu-fadena DNA, ĉiu proksimume 20 bazparoj en longo. La propreco de enkondukoj estas, ke ili respondas al la DNA-sekcioj, kiuj devas esti plifortigitaj, tio estas, la DNA-ŝablono.
(Bildo klakebla) Kary Mullis, inventinto de PCR
La specifeco de PCR estas bazita sur la formado de komplementaj kompleksoj inter la ŝablono kaj enkondukoj, mallongaj sintezaj oligonukleotidoj. Ĉiu enkonduko estas komplementa al unu el la fadenoj de la duoble-senhelpa ŝablono kaj limigas la komencon kaj finon de la plifortigita regiono. Fakte, la rezulta "matrico" estas tuta genaro, kaj nia celo estas izoli de ĝi la fragmentojn interesajn por ni. Por fari tion, la duoble-fadena DNA-ŝablono estas varmigita ĝis 95 °C dum pluraj minutoj por apartigi la DNA-fadenojn. Ĉi tiu etapo estas nomita denaturado ĉar la hidrogenaj ligoj inter la du DNA-fadenoj estas rompitaj. Post kiam la fadenoj disiĝis, la temperaturo estas malaltigita por permesi al la enkondukoj ligi al la unu-senhelpa ŝablono. DNA-polimerazo komencas DNA-reproduktadon per ligado al peco de nukleotidĉeno. La enzima DNA-polimerazo reproduktas la ŝablonfadenon uzante enkondukon kiel enkondukon aŭ ekzemplon por kopiado. Kiel rezulto de la unua ciklo, ni akiras multoblan sinsekvan duobligon de certa DNA-sekcio. Poste ni ripetas ĉi tiun proceduron. Post ĉiu ciklo ni ricevas celon en duobla kvanto. Post dudek kvin PCR-cikloj (tio estas, en malpli ol du horoj), ni havas la DNA-regionon interesan al ni en kvanto 225 fojojn pli alta ol la originalo (tio estas, ni pligrandigis ĝin proksimume 34 milionojn da fojoj). Fakte, ĉe la enigo ni ricevis miksaĵon de enkondukoj, ŝablona DNA, la DNA-polimerazo-enzimo kaj liberaj bazoj A, C, G kaj T, la kvanto de specifa reagprodukto (limigita de la enkondukoj) kreskas eksponente, kaj la nombro de "longaj" DNA-kopioj estas lineara, do en reago produktoj dominas.
Plifortigo de la dezirata DNA-sekcio: polimeraza ĉenreakcio
En la fruaj tagoj de PCR, la ĉefa problemo estis la sekva: post ĉiu hejtado-malvarmigo ciklo, DNA-polimerazo devis esti aldonita al la reakcia miksaĵo, ĉar ĝi estis malaktivigita je temperaturo de 95 ° C. Tial, estis necese re-aldoni ĝin antaŭ ĉiu el la 25 cikloj. La reakcia proceduro estis relative malefika, postulis multan tempon kaj la polimerazan enzimon, kaj la materialo estis tre multekosta. Feliĉe, Patrino Naturo venis al la savo. Multaj bestoj sentas sin komfortaj ĉe temperaturoj multe pli altaj ol 37 °C. Kial la figuro 37 °C fariĝis grava por ni? Tio okazis ĉar tiu temperaturo estas optimuma por E. coli, de kiu la polimeraza enzimo por PCR estis origine akirita. En la naturo estas mikroorganismoj, kies proteinoj, dum milionoj da jaroj da natura selektado, fariĝis pli rezistemaj al altaj temperaturoj. Estis svatite uzi DNA-polimerazojn de termofilaj bakterioj. Tiuj enzimoj montriĝis por termostabilaj kaj povis elteni multajn reagciklojn. Ilia uzo ebligis simpligi kaj aŭtomatigi PCR. Unu el la unuaj termostabilaj DNA-polimerazoj estis izolita de la bakterio Thermus aquaticus, kiu vivas en la termofontoj de Nacia Parko Yellowstone, kaj estis nomita Taq-polimerazo.
PCR rapide iĝis la laborĉevalo de la Homa Genaro-Projekto. Ĝenerale, la procezo ne diferencas de tiu evoluigita de Mullis, ĝi ĵus estis aŭtomatigita. Ni ne plu dependis de amaso da malklaraj diplomiĝaj studentoj pene verŝantaj gutetojn da likvaĵo en plastajn provtubojn. En modernaj laboratorioj farantaj molekulan genetikan esploradon, ĉi tiu laboro estas farita sur robotaj transportiloj. PCR-robotoj implikitaj en sekvenca projekto tiel granda kiel la Homa Genaro laboras senĉese kun grandegaj volumoj de varmecstabila polimerazo. Kelkaj sciencistoj laborantaj pri la Homa Genaro-Projekto estis kolerigitaj pro la senracie altaj tantiemoj aldonitaj al la kosto de konsumeblaj fare de la posedanto de la PCR-patento, la eŭropa industria farmacia giganto Hoffmann-LaRoche.
Alia "veturanta principo" estis la DNA-sekvenca metodo mem. La kemia bazo de tiu ĉi metodo ne plu estis nova en tiu tempo: la Interstate Human Genome Project (HGP) adoptis la saman inĝenian metodon kiun Fred Sanger evoluigis reen en la mez-1970-aj jaroj. La novigado kuŝis en la skalo kaj grado da aŭtomatigo kiun sekvencado povis atingi.
Aŭtomatigita sekvencado estis origine evoluigita en la laboratorio de Lee Hood ĉe la Kalifornia Instituto de Teknologio. Li ekzamenis mezlernejon en Montano kaj ludis kolegiopiedpilkon kiel ricevisto; Danke al Hood, la teamo venkis en la ŝtata ĉampioneco pli ol unufoje. Liaj teamlaborkapabloj ankaŭ estis utilaj en lia scienca kariero. La laboratorio de Hood estis homekipita fare de diversa skipo de apotekistoj, biologoj, kaj inĝenieroj, kaj lia laboratorio baldaŭ iĝis gvidanto en teknologia novigado.
Fakte, la aŭtomatigita sekvenca metodo estis inventita fare de Lloyd Smith kaj Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, tiam laboranta en la laboratorio de Hood, kontaktis Lloyd Smith kun propono por plibonigita sekvencmetodo en kiu ĉiu speco de bazo estus kolorigita alimaniere. Tia ideo povus kvarobligi la efikecon de la Sanger-procezo. En Sanger, sekvencante en ĉiu el kvar tuboj (laŭ la nombro da bazoj), kun la partopreno de DNA-polimerazo, estas formita unika aro de oligonukleotidoj de malsamaj longoj, inkluzive de primer-sekvenco. Poste, formamido estis aldonita al la tuboj por ĉendisigo kaj poliakrilata ĝela elektroforezo estis farita sur kvar lenoj. En la versio de Smith kaj Hunkapiller, dideoksinucleotidoj estas etikeditaj kun kvar malsamaj tinkturfarboj kaj PCR estas farita en unu tubo. Tiam, dum poliakrilamida ĝelelektroforezo, lasera radio ĉe specifa loko sur la ĝelo ekscitas la agadon de la tinkturfarboj, kaj la detektilo determinas kiu nukleotido nuntempe migras tra la ĝelo. Komence, Smith estis pesimisma - li timis ke uzi ultramalaltajn dozojn de tinkturfarbo kondukus al la nukleotidregionoj esti nedistingeblaj. Tamen, havante bonegan komprenon de lasera teknologio, li baldaŭ trovis elirejon de la situacio uzante specialajn fluorokromajn tinkturfarbojn kiuj fluoreskas kiam eksponite al lasera radiado.
(Plena versio - 4,08 MB) Bela lisaĵo: DNA-sekvenco sekvencita per aŭtomata sekvencilo, akirita de aŭtomata sekvencimaŝino. Ĉiu koloro respondas al unu el kvar bazoj
En la klasika versio de la metodo Sanger, unu el la fadenoj de la analizita DNA funkcias kiel ŝablono por la sintezo de komplementa fadeno per la enzima DNA-polimerazo, tiam la sekvenco de DNA-fragmentoj estas ordigita en ĝelo laŭ grandeco. Ĉiu fragmento, kiu estas inkluzivita en la DNA dum sintezo kaj permesas postan bildigon de reagproduktoj, estas etikedita kun fluoreska tinkturo responda al la fina bazo (ĉi tio estis diskutita sur p. 124); tial, la fluoreskeco de ĉi tiu fragmento estos identigilo por antaŭfiksita bazo. Tiam ĉio, kio restas, estas elfari detekton kaj bildigi la reagproduktojn. La rezultoj estas analizitaj per komputilo kaj prezentitaj kiel sekvenco de plurkoloraj pintoj egalrilatantaj al kvar nukleotidoj. La informoj tiam estas transdonitaj rekte al la informsistemo de la komputilo, eliminante la tempopostulan kaj foje doloran datenenirprocezon kiu igis sekvencon tre malfacila.
» Pliaj detaloj pri la libro troveblas ĉe
»
»
Por Khabrozhiteley 25% rabato uzante kuponon - PCR
fonto: www.habr.com