En California, a la edad de 74 años, falleció el laureado estadounidense del Premio Nobel de Química, Kary Mullis. Según su esposa, la muerte ocurrió el 7 de agosto. La causa fue insuficiencia cardíaca y respiratoria debido a una neumonía.
James Watson, descubridor de la molécula de ADN, nos contará sobre la contribución que hizo a la bioquímica y por qué recibió el Premio Nobel.
Extracto del libro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. La historia de la revolución genética
Capítulo 7. El genoma humano. El guion de la vida
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue inventada en 1983 por el bioquímico Kary Mullis, que trabajaba en la empresa Cetus. El descubrimiento de esta reacción fue bastante notable. Más tarde, Mullis recordaba: "Una noche de viernes en abril de 1983, como si me hubiera iluminado. Estaba conduciendo por una sinuosa carretera montañosa iluminada por la luna en el norte de California, cerca de los bosques de secuoyas". Impresiona que fue en tal situación donde encontró la inspiración. No se trata de que las carreteras del norte de California sean especiales para la iluminación; simplemente, su amigo había visto una vez a Mullis conduciendo imprudentemente por una carretera helada de doble sentido, lo que no le preocupaba en absoluto. Su amigo le dijo al New York Times lo siguiente: "Mullis soñó que moriría al chocar contra una secuoya. Por eso, no le tiene miedo a conducir, siempre que no haya secuoyas a lo largo del camino". La presencia de secuoyas a lo largo de la carretera hizo que Mullis se concentrara y... ahí estaba, la iluminación. Por su invento, en 1993 Mullis recibió el Premio Nobel de Química y desde entonces se volvió aún más extraño en sus acciones. Por ejemplo, es un defensor de la teoría revisionista de que el SIDA no está relacionado con el VIH, lo que socavó considerablemente su propia reputación y dificultó a los médicos.
La PCR es una reacción bastante simple. Para llevarla a cabo, necesitamos dos primers sintéticos químicamente, complementarios a los extremos opuestos de diferentes cadenas del fragmento de ADN requerido. Los primers son pequeñas secciones de ADN de cadena simple, cada uno de aproximadamente 20 pares de bases de longitud. La característica de los primers es que se corresponden con las secciones de ADN que se necesita amplificar, es decir, la matriz de ADN.
(La imagen es clickeable) Kary Mullis, inventor de la PCR
La especificidad de la PCR se basa en la formación de complejos complementarios entre la matriz y los primers, que son oligonucleótidos sintéticos cortos. Cada uno de los primers es complementario a una de las hebras de la matriz de ADN bicatenario y limita el inicio y el final de la región que se va a amplificar. La 'matriz' obtenida representa un genoma completo, y nuestro objetivo es aislar de ella los fragmentos que nos interesan. Para ello, se calienta la matriz de ADN bicatenario a 95 °C durante varios minutos, para que las hebras de ADN se separen. Esta etapa se llama desnaturalización, ya que se rompen los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras de ADN. Cuando las hebras se separan, se reduce la temperatura para que los primers puedan unirse a la matriz de ADN de cadena sencilla. La ADN polimerasa comienza la replicación del ADN, uniéndose a un segmento de la cadena de nucleótidos. La enzima ADN polimerasa replica la hebra matriz, utilizando el primer como iniciador o ejemplar para copiar. Como resultado del primer ciclo, obtenemos una duplicación secuencial del segmento de ADN deseado. Luego repetimos este procedimiento. Después de cada ciclo, obtenemos la región objetivo en el doble de cantidad. Después de veinticinco ciclos de PCR (es decir, en menos de dos horas), tenemos la región de ADN que nos interesa en una cantidad 225 veces superior a la inicial (es decir, hemos ampliado su cantidad aproximadamente 34 millones de veces). En realidad, al inicio teníamos una mezcla de primers, ADN matriz, la enzima ADN polimerasa y bases libres A, C, G y T, la cantidad de producto específico de la reacción (limitada por los primers) aumenta exponencialmente, mientras que la cantidad de copias 'largas' de ADN lo hace de manera lineal, por lo tanto, en los productos de la reacción, predominan las copias específicas.
Amplificación de la región deseada de ADN: reacción en cadena de la polimerasa
Al principio del uso de la PCR, el principal problema era el siguiente: después de cada ciclo de calentamiento-enfriamiento, era necesario añadir ADN polimerasa a la mezcla de reacción, ya que se inactivaba a una temperatura de 95 °C. Por lo tanto, había que agregarla de nuevo antes de cada uno de los 25 ciclos. El procedimiento de realizar la reacción era relativamente ineficaz, requería mucho tiempo y la enzima polimerasa es bastante cara. Afortunadamente, la madre naturaleza ofreció su ayuda. Muchos animales se sienten cómodos a temperaturas mucho más altas de 37 °C. ¿Y por qué se convirtió en un número importante para nosotros el 37 °C? Esto sucedió porque esta temperatura es óptima para E. coli, de la cual se obtuvo originalmente la enzima polimerasa para la PCR. En la naturaleza se encuentran microorganismos cuyas proteínas, tras millones de años de selección natural, se volvieron más resistentes a las altas temperaturas. Se propuso utilizar ADN polimerasas de bacterias termófilas. Estas enzimas resultaron ser termostables y pudieron soportar numerosos ciclos de reacción. Su uso permitió simplificar y automatizar la realización de la PCR. Una de las primeras ADN polimerasas termostables fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus, que habita en las fuentes termales del Parque Nacional Yellowstone, y se llamó polimerasa Taq.
La PCR se convirtió rápidamente en el caballo de batalla principal del proyecto 'Genoma Humano'. En general, el proceso no difiere del desarrollado por Mullis, simplemente fue automatizado. Ya no dependíamos de un grupo de becarios casi ciegos, que minuciosamente vertían gotas de líquido en tubos de plástico. En los laboratorios modernos que realizan investigaciones genético-moleculares, este trabajo se lleva a cabo en líneas de producción robóticas. Los robots de PCR, involucrados en un proyecto de gran escala como el 'Genoma Humano', trabajan incansablemente con grandes volúmenes de polimerasa resistente al calor. Algunos científicos que trabajaban en el proyecto 'Genoma Humano' se sintieron indignados por las tasas desmesuradamente altas que añade a los costos de los materiales de consumo el propietario de la patente de la PCR, el gigante industrial y farmacéutico europeo Hoffmann-LaRoche.
Un segundo "motor" fue el propio método de secuenciación de ADN. La base química de este método ya no era una novedad en aquel momento: el proyecto intergubernamental "Genoma Humano" (HGP) adoptó el mismo ingenioso método que desarrolló Fred Sanger a mediados de la década de 1970. La innovación radicaba en la escala y el grado de automatización que se logró en la secuenciación.
La secuenciación automática fue originalmente desarrollada en el laboratorio de Lee Hood en el Instituto Tecnológico de California. Terminó la escuela en el estado de Montana y jugó al fútbol americano como receptor; gracias a Hood, su equipo ganó varias veces el campeonato estatal. Las habilidades de trabajo en equipo le fueron útiles en su carrera científica. En el laboratorio de Hood trabajaba un variado grupo de químicos, biólogos e ingenieros, y pronto su laboratorio se convirtió en líder en términos de innovación tecnológica.
De hecho, el método de secuenciación automática fue inventado por Lloyd Smith y Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, quien en ese momento trabajaba en el laboratorio de Hood, se dirigió a Lloyd Smith, proponiéndole un método de secuenciación mejorado en el que las bases de cada tipo se colorearían de manera diferente. Esta idea podría aumentar la eficiencia del proceso de Sanger hasta cuatro veces. En el método de Sanger, se forma un conjunto único de oligonucleótidos de diferentes longitudes en cada uno de los cuatro tubos de ensayo (correspondientes al número de bases) con la ayuda de la ADN polimerasa, que incluye la secuencia del cebador. Luego, se añadía formamida a los tubos para separar las cadenas y se realizaba la electroforesis en gel de poliacrilamida en cuatro carriles. En la variante de Smith y Hunkapiller, los didesoxinucleótidos se marcaban con cuatro colorantes diferentes y se llevaba a cabo PCR en un solo tubo. Luego, durante la electroforesis en gel de poliacrilamida, un rayo láser en un punto específico del gel excita la actividad de los colorantes, y el detector determina qué nucleótido está migrando a través del gel en ese momento. Al principio, Smith estaba pesimista; temía que el uso de dosis extremadamente pequeñas de colorante hiciera que las regiones nucleotídicas fueran indistinguibles. Sin embargo, siendo un experto en tecnologías láser, pronto encontró una solución utilizando colorantes fluorescentes especiales que fluorescen bajo la acción de la radiación láser.
(Versión completa — 4,08 MB) En letras pequeñas: secuencia de ADN, descifrada utilizando un secuenciador automático, obtenida del dispositivo de secuenciación automática. Cada color corresponde a una de las cuatro bases.
En la variante clásica del método de Sanger, una de las cadenas de ADN analizadas actúa como matriz para la síntesis de la cadena complementaria por la enzima ADN polimerasa; luego, la secuencia de fragmentos de ADN se separa en un gel según su tamaño. Cada fragmento que se incorpora al ADN durante la síntesis y que permite visualizar posteriormente los productos de la reacción se marca con un colorante fluorescente correspondiente a la base terminal (esto se mencionó en la p. 124); por lo tanto, la fluorescencia de este fragmento será el identificador para esta base. Luego, solo queda realizar la detección y visualizar los productos de la reacción. Los resultados se analizan con la ayuda de una computadora y se presentan como una secuencia de picos de colores, correspondientes a los cuatro nucleótidos. A continuación, la información se transmite directamente al sistema informático del ordenador, lo que elimina el proceso de entrada de datos, largo y a veces tortuoso, que complicaba considerablemente la secuenciación.
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Fuente: habr.com
