El premio Nobel estadounidense de química Kary Mullis murió en California a la edad de 74 años. Según su esposa, la muerte se produjo el 7 de agosto. La causa es insuficiencia cardíaca y respiratoria debido a neumonía.
El propio James Watson, descubridor de la molécula de ADN, nos contará la contribución que hizo a la bioquímica y por la que recibió el Premio Nobel.
Extracto del libro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. Historia de la revolución genética
Capítulo 7. Genoma humano. Escenario de vida
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue inventada en 1983 por la bioquímica Carey Mullis, que trabajaba en Cetus. El descubrimiento de esta reacción fue bastante notable. Mullis recordó más tarde: “Un viernes por la tarde en abril de 1983, tuve una epifanía. Estaba detrás del volante, conduciendo por una sinuosa carretera de montaña iluminada por la luna en el norte de California, la tierra de los bosques de secuoyas”. Es impresionante que fue en tal situación que le llegó la inspiración. Y no es que el norte de California tenga caminos especiales que promuevan el conocimiento; es solo que su amigo una vez vio a Mullis acelerando imprudentemente por una autovía helada y eso no le molestó en absoluto. Un amigo le dijo al New York Times: “Mullis tuvo una visión en la que moriría estrellándose contra una secuoya. Por lo tanto, no le teme a nada mientras conduce, a menos que haya secuoyas creciendo a lo largo del camino”. La presencia de secuoyas a lo largo del camino obligó a Mullis a concentrarse y... aquí estaba, una idea. Mullis recibió el Premio Nobel de Química por su invento en 1993 y desde entonces sus acciones se han vuelto aún más extrañas. Por ejemplo, apoya la teoría revisionista de que el SIDA no está relacionado con el VIH, lo que socavó significativamente su propia reputación e interfirió con los médicos.
La PCR es una reacción bastante simple. Para llevarlo a cabo necesitamos dos cebadores sintetizados químicamente que sean complementarios de los extremos opuestos de diferentes hebras del fragmento de ADN requerido. Los cebadores son secciones cortas de ADN monocatenario, cada una de aproximadamente 20 pares de bases de longitud. La peculiaridad de los cebadores es que corresponden a las secciones de ADN que necesitan amplificarse, es decir, la plantilla de ADN.
(Imagen en la que se puede hacer clic) Kary Mullis, inventora de la PCR
La especificidad de la PCR se basa en la formación de complejos complementarios entre el molde y los cebadores, oligonucleótidos sintéticos cortos. Cada cebador es complementario a una de las hebras del molde bicatenario y limita el principio y el final de la región amplificada. De hecho, la "matriz" resultante es un genoma completo, y nuestro objetivo es aislar de él los fragmentos que nos interesan. Para ello, la plantilla de ADN bicatenario se calienta a 95 °C durante varios minutos para separar las cadenas de ADN. Esta etapa se llama desnaturalización porque se rompen los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN. Una vez que las hebras se han separado, se reduce la temperatura para permitir que los cebadores se unan a la plantilla monocatenaria. La ADN polimerasa comienza la replicación del ADN uniéndose a un tramo de cadena de nucleótidos. La enzima ADN polimerasa replica la cadena plantilla utilizando un cebador como cebador o ejemplo para copiar. Como resultado del primer ciclo, obtenemos múltiples duplicaciones secuenciales de una determinada sección de ADN. A continuación repetimos este procedimiento. Después de cada ciclo obtenemos una superficie objetivo en cantidad doble. Tras veinticinco ciclos de PCR (es decir, en menos de dos horas), tenemos la región de ADN que nos interesa en una cantidad 225 veces superior a la original (es decir, la hemos amplificado aproximadamente 34 millones de veces). De hecho, en la entrada recibimos una mezcla de cebadores, ADN molde, la enzima ADN polimerasa y las bases libres A, C, G y T, la cantidad de un producto de reacción específico (limitado por los cebadores) crece exponencialmente y el número La producción de copias “largas” de ADN es lineal, por lo que en los productos de reacción predomina.
Amplificación de la sección de ADN deseada: reacción en cadena de la polimerasa
En los primeros tiempos de la PCR, el principal problema era el siguiente: después de cada ciclo de calentamiento-enfriamiento, había que añadir ADN polimerasa a la mezcla de reacción, ya que se inactivaba a una temperatura de 95°C. Por lo tanto, fue necesario volver a agregarlo antes de cada uno de los 25 ciclos. El procedimiento de reacción fue relativamente ineficaz, requirió mucho tiempo y la enzima polimerasa, y el material era muy caro. Por suerte, la Madre Naturaleza vino al rescate. Muchos animales se sienten cómodos a temperaturas muy superiores a los 37 °C. ¿Por qué se volvió importante para nosotros la cifra de 37 °C? Esto sucedió porque esta temperatura es óptima para E. coli, de donde se obtuvo originalmente la enzima polimerasa para PCR. En la naturaleza existen microorganismos cuyas proteínas, a lo largo de millones de años de selección natural, se han vuelto más resistentes a las altas temperaturas. Se ha propuesto utilizar ADN polimerasas de bacterias termófilas. Estas enzimas resultaron ser termoestables y capaces de soportar muchos ciclos de reacción. Su uso permitió simplificar y automatizar la PCR. Una de las primeras ADN polimerasas termoestables se aisló de la bacteria Thermus Aquaticus, que vive en las aguas termales del Parque Nacional de Yellowstone, y recibió el nombre de polimerasa Taq.
La PCR se convirtió rápidamente en el caballo de batalla del Proyecto Genoma Humano. En general, el proceso no es diferente al desarrollado por Mullis, simplemente ha sido automatizado. Ya no dependíamos de una multitud de estudiantes de posgrado tontos que vertían minuciosamente gotas de líquido en tubos de ensayo de plástico. En los laboratorios modernos que realizan investigaciones de genética molecular, este trabajo se realiza sobre transportadores robóticos. Los robots de PCR involucrados en un proyecto de secuenciación tan grande como el Genoma Humano trabajan sin descanso con enormes volúmenes de polimerasa termoestable. Algunos científicos que trabajan en el Proyecto Genoma Humano estaban indignados por las regalías excesivamente altas que el propietario de la patente de PCR, el gigante farmacéutico industrial europeo Hoffmann-LaRoche, añadía al coste de los consumibles.
Otro “principio impulsor” fue el propio método de secuenciación del ADN. La base química de este método ya no era nueva en aquel momento: el Proyecto Interestatal del Genoma Humano (PGH) adoptó el mismo método ingenioso que Fred Sanger había desarrollado a mediados de los años 1970. La innovación residió en la escala y el grado de automatización que se pudo lograr con la secuenciación.
La secuenciación automatizada se desarrolló originalmente en el laboratorio de Lee Hood en el Instituto de Tecnología de California. Asistió a la escuela secundaria en Montana y jugó fútbol americano universitario como mariscal de campo; Gracias a Hood, el equipo ganó el campeonato estatal más de una vez. Sus habilidades para trabajar en equipo también le resultaron útiles en su carrera científica. El laboratorio de Hood estaba integrado por un equipo variopinto de químicos, biólogos e ingenieros, y su laboratorio pronto se convirtió en líder en innovación tecnológica.
De hecho, el método de secuenciación automatizada fue inventado por Lloyd Smith y Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que entonces trabajaba en el laboratorio de Hood, se acercó a Lloyd Smith con una propuesta para un método de secuenciación mejorado en el que cada tipo de base tendría un color diferente. Una idea así podría cuadruplicar la eficiencia del proceso Sanger. En Sanger, al secuenciar en cada uno de los cuatro tubos (según el número de bases), con la participación de la ADN polimerasa, se forma un conjunto único de oligonucleótidos de diferentes longitudes, incluida una secuencia de cebador. A continuación, se añadió formamida a los tubos para la separación de cadenas y se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida en cuatro carriles. En la versión de Smith y Hunkapiller, los didesoxinucleótidos se marcan con cuatro colorantes diferentes y la PCR se realiza en un tubo. Luego, durante la electroforesis en gel de poliacrilamida, un rayo láser en un lugar específico del gel excita la actividad de los tintes y el detector determina qué nucleótido está migrando actualmente a través del gel. Al principio, Smith se mostró pesimista: temía que el uso de dosis ultrabajas de colorante provocaría que las regiones de nucleótidos fueran indistinguibles. Sin embargo, al tener un excelente conocimiento de la tecnología láser, pronto encontró una salida a la situación mediante el uso de tintes especiales de fluorocromo que emiten fluorescencia cuando se exponen a la radiación láser.
(Versión completa - 4,08 MB) Letra pequeña: Secuencia de ADN secuenciada mediante secuenciador automático, obtenida de una máquina secuenciadora automática. Cada color corresponde a una de las cuatro bases.
En la versión clásica del método Sanger, una de las hebras del ADN analizado actúa como plantilla para la síntesis de una hebra complementaria mediante la enzima ADN polimerasa, luego la secuencia de fragmentos de ADN se clasifica en un gel por tamaño. Cada fragmento que se incluye en el ADN durante la síntesis y permite la visualización posterior de los productos de la reacción se marca con un tinte fluorescente correspondiente a la base terminal (esto se discutió en la página 124); por tanto, la fluorescencia de este fragmento será un identificador de una base determinada. Entonces solo queda realizar la detección y visualizar los productos de la reacción. Los resultados se analizan por computadora y se presentan como una secuencia de picos multicolores correspondientes a cuatro nucleótidos. Luego, la información se transfiere directamente al sistema de información de la computadora, eliminando el lento y a veces doloroso proceso de ingreso de datos que dificultaba mucho la secuenciación.
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Fuente: habr.com