California osariigis suri 74-aastaselt Ameerika Ühendriikide keemia Nobel'i laureaat Carey Mullis. Tema abikaasa sõnul surm leidis aset 7. augustil. Põhjus oli südame- ja hingamispuudulikkus kopsupõletiku tõttu.
Millist panust andis ta biokeemiasse ja miks ta sai Nobel'i preemia, räägib meile James Watson — DNA molekuli avastaja.
Katkend James Watsoni, Andrew Barry ja Kevin Davise raamatust
DNA. Geneetilise revolutsiooni ajalugu
Peatükk 7. Inimgenoom. Elustsenaarium
…
Polümeraasreaktsioon (PCR) leiutati 1983. aastal biokeemiku Carey Mullise poolt, kes töötas ettevõttes Cetus. Selle reaktsiooni avastus oli väga märkimisväärne. Hiljem meenutas Mullis: „Ühel reede õhtul aprillis 1983 tabas mind nagu välk. Olin roolis, sõites mööda kuuvalgusega valgustatud kurvilist mägiteed Põhja-California sekvoiapuidu metsade lähedal.” Imeline on see, et just sellises olukorras tabas teda inspiratsioon. Asi ei ole selles, et Põhja-California teedel oleks midagi eriliselt inspireerivat; lihtsalt tema sõber oli kunagi näinud, kuidas Mullis hullunult kiirusel sõitis libedal kahelõigulisel teel ning see ei häirinud teda sugugi. Sõber ütles New York Times'ile järgmist: „Mullisele ilmus ettekujutus, et ta hukkub sekvoiale otsasõiduga. Seetõttu ei karda ta roolis, kui tee ääres ei kasva sekvoiaid.” Sekvoia kohalolek tee ääres sundis Mullist keskenduma ja… see oli ärkamine. Oma leiutise eest sai Mullis 1993. aastal keemia Nobel'i preemia ning temast sai veelgi veidram isiksus. Näiteks toetab ta revizionistlikku teooriat, et AIDS ei ole seotud HIV-iga, mis on oluliselt kahjustanud tema mainet ja takistanud arste.
PCR on üsna lihtne reaktsioon. Selle läbiviimiseks on vajalikud kaks keemiliselt sünteesitud primerit, mis on komplementaarsed nõutava DNA fragmendi erinevate ahelate vastupidistele äärmistele osadele. Primerid on lühikesed üheahelalise DNA osad, igaühe pikkus on umbes 20 aluspaaride kaupa. Primerite eripära on see, et need sobivad DNA lõikudele, mida tuleb amplifitseerida, st DNA-matrexile.
(Kujutis on klikatav) Kary Mullis, PCR-i leiutaja
PCR-i spetsiifilisus põhineb komplementaarsete komplekside moodustumisel matriitsi ja primerite vahel, lühikeste sünteetiliste oligonukleotiidide. Iga primer on komplementaarne ühe kaheahelalise matriitsiga ja piirab amplifitseeritava ala algust ja lõppu. Tegelikult esindab saadud "matriits" tervet genoomi ning meie eesmärk on eraldada sellest huvipakuvaid fragmente. Selleks kuumutatakse kaheahelaline DNA-matriits 95 °C juures paariks minutiks, et DNA ahelad oleksid eraldi. Seda etappi nimetatakse denaturatsiooniks, kuna purunevad vesiniksidemed kahe DNA ahela vahel. Kui ahelad on eraldatud, alandatakse temperatuuri, et primerid saaksid siduda üheahelalise matriitsiga. DNA polümeraas alustab DNA replikatsiooni, sidudes end nukleotiidide ahela tükiga. DNA polümeraasi ensüüm replitseerib matriitsahelat, kasutades primerit alustena koopiate tegemiseks. Esimese tsükli tulemuseks saame sihitud DNA ala korduva järjestikuse kahekordistumise. Seejärel kordame seda protseduuri. Iga tsükli järel saame sihialalt kahekordse hulga. Kakskümmend viis PCR-i tsüklit hiljem (ehk vähem kui kahe tunni pärast) on huvipakkuva DNA ala kogus 225 korda suurem algsest (ehk oleme selle amplifitseerinud umbes 34 miljonit korda). Tegelikult oli meil alguses segu primeritest, matriit DNA-st, DNA polümeraasi ensüümist ja vabasid aluseid A, C, G ja T, ja reaktsiooni spetsiifilise toote (primerite poolt piiratud) kogus kasvab eksponentsiaalselt, samas kui "pikkade" DNA koopiate arv on lineaarselt, seega reaktsiooni toodete hulk domineerib.
Vajalikku DNA ala amplifitseerimine: polümeraasi ahelreaktsioon
PCR-i kasutamise alguses seisnes peamine probleem selles, et iga kuumutus-ja jahutustsükli järel tuli reaktsioonisegusse lisada DNA-polümeraasi, kuna see inactiveeriti temperatuuril 95 °C. Seetõttu tuli seda uuesti lisada enne iga ühte 25 tsüklist. Reaktsiooni teostamise protseduur oli suhteliselt ebaefektiivne, nõudis palju aega ja polümeraasi ensüümi, mis on üsna kallis materjal. Õnneks tuli appi loodus. Paljud loomad tunnevad end mugavalt temperatuuridel, mis on palju kõrgemad kui 37 °C. Miks sai meie jaoks oluline number 37 °C? See juhtus seetõttu, et see temperatuur on optimaalne E. coli jaoks, millest algselt saadud polümeraasi ensüüm PCR-i jaoks. Looduses leidub mikroorganisme, mille valkude loomulikud omadused on miljoneid aastaid looduslikku valikut läbides muutunud kõrgemate temperatuuride suhtes vastupidavamaks. On soovitatud kasutada termofiilsete bakterite DNA-polümeraase. Need ensüümid osutusid termostabiilseteks ja olid võimelised taluma mitmeid reaktsiooni tsükleid. Nende kasutamine aitas PCR-i teostamist lihtsustada ja automatiseerida. Üks esimesi termostabiilseid DNA-polümeraase isolatsiooniks saadi Thermus aquaticus bakterist, mis elab Yellowstone'i rahvuspargi kuumades allikates, ja seda nimetati Taq-polümeraasiks.
PCR muutus kiiresti inimese genoomi projekti peamiseks tööriistaks. Üldiselt ei erine protsess Mullise välja töötatust, vaid see on automatiseeritud. Me ei sõltunud enam hulkadest pimedatest teadlastest, kes hoolikalt tilgutasid vedelikku plasttorudesse. Kaasaegsetes laborites, mis teostavad molekulaargeneetilisi uuringuid, teevad seda tööd robotiseeritud konveierid. PCR-robotid, kes on seotud nii suures ulatuses nagu "Inimese genoom" projekt, töötavad usinasti suurte termostabiilse polümeraasi kogustega. Mõned teadlased, kes töötavad inimese genoomi projekti kallal, olid hämmeldunud patentide omaniku, Euroopa tööstus- ja farmatseutilise hiiglase Hoffmann-LaRoche, ootamatult kõrgete tasudega, mis lisatakse töötlusmaterjalide maksumusele.
Teise „liikuva algina” oli DNA sekveneerimise meetod ise. Selle meetodi keemiline alus ei olnud sel ajal enam uudne: Rahvusvaheline projekt „Inimgenoom” (HGP) kasutas sama nutikat meetodit, mille töötas välja Fred Sanger 1970. aastate keskel. Innovatsioon seisnes aga ulatuses ja automatiseerimise astmes, mida suudeti saavutada sekveneerimisel.
Automatiseeritud sekveneerimine töötati algselt välja Lee Hudi laboratooriumis California Tehnoloogiainstituudis. Ta lõpetas kooli Montanas ja mängis Ameerika jalgpalli ründajana; just Hudi tõttu võitis meeskond korduvalt osariigi meistrivõistlused. Meeskonnatöö oskused aitasid tal ka teaduskarjääris. Hudi laboratooriumis töötas mitmekesine seltskond keemikuid, biolooge ja insenere ning varsti sai tema laboratoorium tehnoloogiliste uuenduste liidriks.
Tegelikult leiutas automaatse sekveneerimise meetodi Lloyd Smith ja Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, kes tol ajal töötas Hoodi laboratooriumis, pöördus Lloyd Smithi poole, pakkudes välja täiustatud sekveneerimise meetodi, kus iga tüüpi nukleotiid värviti oma värviga. Selline idee võis nelja korda tõsta Sangeri protsessi efektiivsust. Sangeri tehnika puhul, sekveneerimise käigus iga neljas katseklaas (vastavalt nukleotiidide arvule) koos DNA-polümeraasiga, tekib ainulaadne oligonukleotiidide kogum erineva pikkusega, mis sisaldab primerjärjestust. Seejärel lisati katseklaasidesse formamiidi, et ahelaid lahutada, ja viidi läbi elektroforees polüaküülamiidgeelis neljal rajal. Smithi ja Hunkapilleri variandis märgistatakse didesoksinukleotiidid nelja erineva värviga ning PCR tehakse ühes katseklaasis. Seejärel aktiveeritakse elektroforeesi ajal polüaküülamiidgeelis laserkiire abil teatud kohas värvide aktiivsus, ja detektor määrab, milline nukleotiid praegu geelist liigub. Alguses oli Smith skeptiline – ta kartis, et väga väikeste värvide annuste kasutamine toob kaasa selle, et nukleotiidipunktid jäävad eristamatuks. Siiski, kuna ta oli laseritehnoloogiates suurepäraselt põhjalik, leidis ta kiiresti lahenduse, kasutades spetsiaalseid fluorofoore, mis fluoresseerivad laserkiirguse toimel.
(Täielik versioon — 4,08 MB) Väikese kirjaga: DNA järjestus, mis on dekodeeritud automaatse sekveneerija abil, saadud automaatse sekveneerimise seadmetest. Iga värv vastab ühele neljast nukleotiidist.
Klassikalise Sangeri meetodi puhul on üks analüüsimiseks valitud DNA ahelatest malliks komplementaarse ahela sünteesi jaoks DNA-polümeraasi ensüümi abil, seejärel järjestatakse DNA fragmendid geelis suuruse järgi. Iga fragment, mis lisatakse DNA-sse sünteesi käigus ja võimaldab hiljem reaktsiooni tooteid visualiseerida, on märgistatud fluorestseeruva värviga, mis vastab terminaalsele alusele (sellest räägiti lk 124); seega on selle fragmendi fluorestsents selle aluse identifikaator. Seejärel on jäänud vaid tuvastada ja visualiseerida reaktsiooni tooted. Tulemusi analüüsitakse arvuti abil ja esitatakse värviliste tipudena, mis vastavad neljale nukleotiidile. Edasi kantakse teave otse arvuti infosisüsteemi, mis välistab ajakuluka ja vahel piinava andmete sisestamise protsessi, mis rasksustas sekveneerimist.
» Raamatuga saab lähemalt tutvuda
»
»
Habr kasutajatele on 25% allahindlus kupongi abil — PCR
Allikas: habr.com
