California's 74-year-old American Nobel laureate in Chemistry, Cary Mullis, has passed away. According to his wife, he died on August 7 due to heart and respiratory failure caused by pneumonia.
James Watson, the co-discoverer of the DNA molecule, will tell us about his contributions to biochemistry and why he received the Nobel Prize.
Excerpt from the book by James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. The Story of the Genetic Revolution
Chapter 7. The Human Genome. The Script of Life
…
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) leiutati 1983. aastal biokeemiku Kary Mullis'i poolt, kes töötas ettevõttes Cetus. Selle reaktsiooni avastus oli väga tähelepanuväärne. Hiljem meenutas Mullis: "Kord aprilli 1983. aasta reedeõhtul tajusin äkki. Ma sõitsin, liikudes mööda heledalt kuuvalguses järske mägiteid Põhja-Californias, sekvoiadest metsade ääres." Muljetavaldav on, et just sellistes tingimustes leidis ta inspiratsiooni. Ja see ei seisne üldsegi selles, et Põhja-Californias oleks eredad teed, mis inspireerivad; hoopis tema sõber nägi kord, kuidas Mullis muretu peaga kihutas libeda kahe suuna teel ega polnud sellest sugugi häiritud. Sõber rääkis New York Times'ile järgmist: "Mullisele jäi mulje, et ta sureb sekvoia sisse sõites. Seetõttu ei karda ta sõites, kui teed mööda ei kasva sekvoiad." Sekvoiate kohalolek tee ääres sundis Mullist keskenduma ja... voilà, inspiratsioon oli kohal. Oma leiutise eest sai Mullis 1993. aastal keemia Nobeli auhinna ning pärast seda muutus ta oma käitumises veelgi erilisemaks. Näiteks toetab ta revizionistlikku teooriat, et AIDSi ei seostata HIV-iga, mis on tõsiselt kahjustanud tema mainet ja seganud arste.
PCR on üsna lihtne reaktsioon. Selle läbiviimiseks on meil vaja kahte keemiliselt sünteesitud primerit, mis on komplementaarsed erinevate DNA fragmentide vastassuundadele. Primerid on lühikesed üheastmelised DNA osad, igaüks umbes 20 aluspaari pikk. Primerite eripära on see, et need sobivad DNA osadega, mida tuleb amplifitseerida, st DNA-materjaliga.
(Pilt on klikatav) Kary Mullis, PCR-i leiutaja
PCR spetsiifilisus põhineb täiendavate komplekside loomisel matriitsi ja primereid, lühikesed sünteetilised oligonukleotiidid. Iga primer on komplementaarne ühe keera topeltheliks matriitsiga ja piirab amplifitseeritava ala algust ja lõppu. Tegelikult saadud "matriits" esindab tervet genoomi ning meie eesmärk on eraldada sealt meid huvitavad fragmendid. Selleks kuumutatakse kaheastmelise DNA matriitsi 95 °C juures mitmeks minutiks, et DNA ahelad eralduksid. Seda etappi nimetatakse denaturatsiooniks, kuna vesiniksidemed kahe DNA ahela vahel purunevad. Kui ahelad on eraldatud, alandatakse temperatuuri, et primerid saaksid seonduda üherhelise matriitsiga. DNA polümeraasi käivitab DNA replikatsiooni, seondudes nukleotiidide ahela lõiguga. DNA polümeraasi ensüüm replitseerib matriitsiahela, kasutades primerit koopia näitena. Esimese tsükli tulemuseks on teatud DNA osa korduv ja järjestikune kahekordistamine. Edasi kordame seda protseduuri. Iga tsükli järel saame sihtala kahekordse koguse. Kakskümmend viis PCR tsüklit hiljem (ehk vähem kui kahe tunni pärast) saame meile huvipakkuva DNA osa koguses, mis ületab algse 225 korda (s.o. meil on see ligikaudu 34 miljonit korda amplifitseeritud). Tegelikult saime me alguses segu primeritest, matriitse, DNA polümeraasi ensüümist ja vabade alus A, C, G ja T, see konkreetse reaktsiooni toote kogus (mis on piiratud primeritega) kasvab eksponentsiaalselt, samas kui "pikad" DNA kopeerimine lineaarne, seega domineerivad reaktsiooni produktides.
DNA vajaliku osa amplifikatsioon: polümeraasi ahelreaktsioon
PCR-i varajamisel seisnes peamine probleem järgmis: iga kuumutamistsükli järel tuli reaktsioonisegusse lisada DNA-polümeraasi, kuna see inaktiveerus temperatuuril 95 °C. Seega tuli see iga 25 tsükli eel uuesti lisada. Reaktsiooni läbiviimise protseduur oli suhteliselt ebaefektiivne, nõudis palju aega ja polümeraasi fermenti, mis on suhteliselt kallis materjal. Õnneks tuli appi ema-loodus. Paljud loomad tunnevad end mugavalt temperatuuridel, mis on palju kõrgemad kui 37 °C. Miks on meie jaoks tähtis just number 37 °C? See tuleneb sellest, et see temperatuur on ideaalne E. coli jaoks, millest algselt saadi polümeraasi ferment PCR-i jaoks. Looduses leidub mikroorganisme, kelle valgud on miljoneid aastaid loodusliku selektsiooni tõttu muutunud kõrgematele temperatuuridele vastupidavamaks. Pakuti välja kasutada termofiilsete bakterite DNA-polümeraase. Need ensüümid osutusid termostabiilseteks ja suudavad taluda mitmeid reaktsiooni tsükleid. Nende kasutamine lihtsustas ja automatiseeris PCR-i läbiviimist. Üks esimesi termostabiilseid DNA-polümeraase eraldati bakterist Thermus aquaticus, mis elab Yellowstone'i rahvuspargi kuumaveeallikates, ja seda nimetati Taq-polümeraasiks.
PCR on kiiresti muutunud projekti "Inimese genoom" peamiseks tööriistaks. Üldiselt ei erine protsess Müllise välja töötatud meetodist, lihtsalt see on automatiseeritud. Me ei sõltunud enam pimedatest doktorantidest, kes valasid tihedalt vedelikku plastikutesse proovidesse. Kaasaegsetes laborites, kus teostatakse molekulaargeneetilisi uuringuid, teeb seda tööd robotiseeritud konveier. PCR-robotid, mis osalevad nii ulatuslikus projekti nagu "Inimese genoom", töötavad vankumatult suurte temperatuurikindlate DNA-polümeraaside kogustega. Mõned teadlased, kes töötavad projekti "Inimese genoom" kallal, olid nördinud ülemäära kõrgetest tasudest, mille lisab tarvikute maksumusele PCR-i patendi omanik, Euroopa tööstus- ja farmaatsiahiiglane Hoffmann-LaRoche.
Teiseks „liikuvaks alguseks“ sai DNA järjestamise meetod. Selle meetodi keemiline alus ei olnud sel ajal enam uudne: rahvusvaheline projekt „Inimese genoom“ (HGP) võttis kasutusele sama nutika meetodi, mille töötas välja Fred Sanger juba 1970. aastate keskel. Uudsus seisnes mastaabis ja automatiseerimise astmes, mida oli võimalik saavutada järjestamisel.
Automaatne järjestamine töötati algselt välja Lee Hudi laboratooriumis California Tehnoloogiainstituudis. Ta lõpetas kooli Montanas ja mängis Ameerika jalgpalli ründajana; tänu Hudile võitis meeskond korduvalt osariigi meistrivõistlused. Meeskonnatöö oskused olid talle kasuks ka teaduskarjääris. Hudi laboratooriumis töötas mitmekesine seltskond keemikuid, biolooge ja insenere ning varsti tõusis tema laboratoorium tehnoloogiliste uuenduste osas esirinda.
Tegelikult leiutasid automaatse sekveneerimise meetodi Lloyd Smith ja Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, kes töötas sel ajal Hudi laboris, pöördus Lloyd Smithi poole, pakkudes välja täiustatud sekveneerimismeetodi, kus iga tüüpi nukleotiid värvitaks eri värviga. Selline idee suutis nelja korra võrra tõsta Sangeri protsessi efektiivsust. Sangeril sekveneerimise käigus luuakse igas neljas katseklaasis (mille arv vastab nukleotiidide arvule) ainulaadne nukleotiidide komplekt, mille pikkused varieeruvad ning sisaldavad primerjärjestust, millega osaleb DNA-polümeraas. Seejärel lisatakse katseklaasidesse formamiid, et ahelad lahkuda, ja tehakse elektroforees polüakreklaamidi geelil neljal radadel. Smithi ja Hunkapilleri variandis värvitakse didesoksünukleotiidid nelja erineva värviga ja PCR viiakse läbi ühes katseklaasis. Seejärel elektroforeesi ajal polüakreklaamidi geelil aktiveerib laserkiir geeli kindlas kohas värvide aktiivsuse, ning detektor määrab, milline nukleotiid parasjagu geelil rändab. Algselt oli Smith pessimistlik — ta kartis, et kasutamine üliväikestes annustes värvi viib selleni, et nukleotiidide osad on eristamatud. Kuid olles suurepäraselt valgustehnoloogiate teadmisega, leidis ta peagi lahenduse, kasutades spetsiaalseid fluorofoorseid värve, mis fluoresseeruvad laserkiirguse mõjul.
(Täielik versioon — 4,08 MB) Väikese kirjatähtedega: DNA järjestus, mis dešifreeriti automaatse sekveneerimise seadmega, saadud automaatse sekveneerimise seadme abil. Iga värv vastab ühele neljast alusest
Sangeri meetodi klassikalises variandis on üks analüüsitava DNA ahelatest matriiks, mille alusel süntesitakse komplementaarne ahel DNA-polümeraasensüümi abil. Seejärel sorteeritakse DNA fragmentide järjestused geelil suuruse järgi. Iga fragment, mis kaasatakse DNA koosseisu süntesi käigus ja võimaldab hiljem reaktsiooni tooteid visualiseerida, märgistatakse fluoressentsvärviga, mis vastab terminalile alusele (millest räägiti lk 124); seega on selle fragmendi fluoressents antud aluse identifikaator. Seejärel tuleb vaid tuvastamine ja reaktsiooni toodete visualiseerimine. Tulemusi analüüsitakse arvuti abil ja esitatakse neljakordsete nukleotiide vastavate erivärviliste tippudena. Seejärel antakse teave otse arvuti infosüsteemi, mis välistab ajakuluka ja tihti vaevarikka andmete sisestamise protsessi, mis väga raskendas sekveneerimist.
» Raamatu kohta on täiendavat teavet saadaval
»
»
Habr'i lugejatele 25% allahindlus kupongiga — PCR
Allikas: habr.com
