USA Nobeli keemiapreemia laureaat Kary Mullis suri Californias 74-aastaselt. Tema naise sõnul saabus surm 7. augustil. Põhjuseks on kopsupõletikust tingitud südame- ja hingamispuudulikkus.
DNA molekuli avastaja James Watson ise räägib meile oma panusest biokeemiasse ja mille eest ta sai Nobeli preemia.
Katkend James Watsoni, Andrew Berry, Kevin Davise raamatust
DNA. Geneetilise revolutsiooni ajalugu
Peatükk 7. Inimese genoom. Elu stsenaarium
...
Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) leiutas 1983. aastal biokeemik Carey Mullis, kes töötas ettevõttes Cetus. Selle reaktsiooni avastamine oli üsna tähelepanuväärne. Mullis meenutas hiljem: „Ühel reede õhtul 1983. aasta aprillis oli mul epifaania. Olin roolis ja sõitsin mööda kuuvalgel käänulist mägiteed Põhja-Californias, sekvoiametsade maal. Muljetavaldav, et just sellises olukorras tabas teda inspiratsioon. Ja asi pole selles, et Põhja-Californias on eriteed, mis edendavad arusaamist; lihtsalt tema sõber nägi kord Mullist mööda jäist kaherajalist sõiduteed hoolimatult kihutamas ja see ei häirinud teda üldse. Sõber rääkis New York Timesile: "Mullis nägi nägemust, et ta sureb vastu sekvoiat põrgates. Seetõttu ei karda ta sõidu ajal midagi, välja arvatud juhul, kui tee ääres kasvavad sekvoiad.» Sekvoia olemasolu tee ääres sundis Mullist keskenduma ja... siin see oli, ülevaade. Mullis sai 1993. aastal oma leiutise eest Nobeli keemiaauhinna ja on sellest ajast peale muutunud oma tegudes veelgi kummalisemaks. Näiteks toetab ta revisionistlikku teooriat, mille kohaselt AIDS ei ole seotud HIV-iga, mis õõnestas oluliselt tema enda mainet ja segas arste.
PCR on üsna lihtne reaktsioon. Selle teostamiseks vajame kahte keemiliselt sünteesitud praimerit, mis on komplementaarsed vajaliku DNA fragmendi erinevate ahelate vastasotstega. Praimerid on üheahelalise DNA lühikesed lõigud, millest igaüks on umbes 20 aluspaari pikk. Praimerite eripära on see, et need vastavad amplifitseerimist vajavatele DNA lõikudele ehk DNA matriitsile.
(Pilt klõpsatav) Kary Mullis, PCR leiutaja
PCR spetsiifilisus põhineb komplementaarsete komplekside moodustumisel matriitsi ja praimerite, lühikeste sünteetiliste oligonukleotiidide vahel. Iga praimer on komplementaarne kaheahelalise matriitsi ühe ahelaga ja piirab amplifitseeritud piirkonna algust ja lõppu. Tegelikult on saadud "maatriks" terve genoom ja meie eesmärk on isoleerida meid huvitavad fragmendid sellest. Selleks kuumutatakse kaheahelalist DNA matriitsi 95 °C juures mitu minutit, et eraldada DNA ahelad. Seda etappi nimetatakse denaturatsiooniks, kuna vesiniksidemed kahe DNA ahela vahel on katkenud. Kui kiud on eraldunud, alandatakse temperatuuri, et praimerid saaksid seonduda üheahelalise malliga. DNA polümeraas alustab DNA replikatsiooni, seondudes nukleotiidahela lõiguga. Ensüüm DNA polümeraas replitseerib matriitsi ahelat, kasutades praimerit praimerina või kopeerimise näitena. Esimese tsükli tulemusena saame teatud DNA lõigu mitmekordse järjestikuse kahekordistumise. Järgmisena kordame seda protseduuri. Pärast iga tsüklit saame sihtala kahekordses koguses. Pärast 225 PCR-tsüklit (st vähem kui kahe tunni jooksul) on meid huvitava DNA piirkonna kogus 34 korda suurem kui originaal (see tähendab, et oleme võimendanud seda ligikaudu XNUMX miljonit korda). Tegelikult saime sisendis praimerite, matriitsi DNA, DNA polümeraasi ensüümi ja vabade aluste A, C, G ja T segu, konkreetse reaktsioonisaaduse kogus (piiratud praimeritega) kasvab eksponentsiaalselt ja arv. "Pikkade" DNA koopiate hulk on lineaarne, seega domineerivad reaktsioonisaadused.
Soovitud DNA lõigu amplifitseerimine: polümeraasi ahelreaktsioon
PCR-i esimestel päevadel oli põhiprobleem järgmine: pärast iga kuumutamis-jahutustsüklit tuli reaktsioonisegule lisada DNA polümeraas, kuna see inaktiveeriti temperatuuril 95 ° C. Seetõttu oli vaja see enne iga 25 tsüklit uuesti lisada. Reaktsiooniprotseduur oli suhteliselt ebaefektiivne, nõudis palju aega ja polümeraasi ensüümi ning materjal oli väga kallis. Õnneks tuli emake loodus appi. Paljud loomad tunnevad end mugavalt, kui temperatuur on palju kõrgem kui 37 °C. Miks muutus meie jaoks oluliseks arv 37 °C? See juhtus seetõttu, et see temperatuur on optimaalne E. coli jaoks, millest algselt saadi polümeraasi ensüüm PCR jaoks. Looduses leidub mikroorganisme, mille valgud on miljonite aastate jooksul loodusliku valiku käigus muutunud kõrgete temperatuuride suhtes vastupidavamaks. On tehtud ettepanek kasutada termofiilsete bakterite DNA polümeraase. Need ensüümid osutusid termostabiilseteks ja suutsid vastu pidada paljudele reaktsioonitsüklitele. Nende kasutamine võimaldas PCR-i lihtsustada ja automatiseerida. Yellowstone'i rahvuspargi kuumaveeallikates elavast bakterist Thermus aquaticus eraldati üks esimesi termostabiilseid DNA polümeraase ja sai nimeks Taq polümeraas.
PCR-ist sai kiiresti inimgenoomi projekti tööhobune. Üldiselt ei erine protsess Mullise väljatöötatust, see on lihtsalt automatiseeritud. Me ei sõltunud enam hämarate kraadiõppurite rahvahulgast, kes valasid hoolikalt plastkatseklaasidesse vedelikupiisku. Kaasaegsetes molekulaargeneetilisi uuringuid teostavates laborites tehakse seda tööd robotkonveieritel. PCR-robotid, mis osalevad nii suures sekveneerimisprojektis kui inimgenoom, töötavad järeleandmatult tohutute soojusstabiilse polümeraasi kogustega. Mõned inimgenoomi projektiga tegelevad teadlased olid nördinud PCR-i patendi omaniku, Euroopa tööstusfarmaatsiahiiglase Hoffmann-LaRoche'i poolt kulumaterjalide kuludele lisatud põhjendamatult kõrgete autoritasude pärast.
Teine "juhitav põhimõte" oli DNA sekveneerimismeetod ise. Selle meetodi keemiline alus ei olnud tol ajal enam uus: Interstate Human Genome Project (HGP) võttis kasutusele sama geniaalse meetodi, mille Fred Sanger oli välja töötanud juba 1970. aastate keskel. Innovatsioon seisnes automatiseerituse mastaabis ja astmes, mida järjestamine suutis saavutada.
Automatiseeritud sekveneerimine töötati algselt välja California Tehnoloogiainstituudi Lee Hoodi laboris. Ta käis Montanas keskkoolis ja mängis tagamängijana kolledži jalgpalli; Tänu Hoodile võitis meeskond rohkem kui korra riigi meistritiitli. Tema meeskonnatöö oskus tuli kasuks ka tema teadlaskarjääris. Hoodi laboris töötas keemikutest, bioloogidest ja inseneridest koosnev kirju meeskond ning tema laborist sai peagi tehnoloogilise innovatsiooni liider.
Tegelikult leiutasid automatiseeritud järjestusmeetodi Lloyd Smith ja Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, kes töötas tol ajal Hoodi laboris, pöördus Lloyd Smithi poole ettepanekuga täiustatud sekveneerimismeetodi kohta, milles igat tüüpi aluseid värvitaks erinevalt. Selline idee võib Sangeri protsessi tõhususe neljakordistada. Sangeris moodustub DNA polümeraasi osalusel neljas katseklaasis (vastavalt aluste arvule) järjestamisel ainulaadne erineva pikkusega oligonukleotiidide komplekt, sealhulgas praimerjärjestus. Järgmisena lisati torudesse ahela eraldamiseks formamiid ja neljal rajal viidi läbi polüakrüülamiidgeelelektroforees. Smithi ja Hunkapilleri versioonis märgistatakse dideoksünukleotiidid nelja erineva värvainega ja PCR tehakse ühes katseklaasis. Seejärel ergastab polüakrüülamiidgeeli elektroforeesi käigus laserkiir kindlas kohas geelil värvainete aktiivsust ja detektor teeb kindlaks, milline nukleotiid parasjagu läbi geeli migreerub. Alguses oli Smith pessimistlik – ta kartis, et värvaine üliväikeste annuste kasutamine toob kaasa nukleotiidide piirkondade eristamatuse. Omades suurepäraseid teadmisi lasertehnoloogiast, leidis ta aga peagi olukorrast väljapääsu, kasutades selleks spetsiaalseid fluorokroomvärve, mis laserkiirgusega kokkupuutel fluorestseeruvad.
(Täisversioon - 4,08 MB) Peen kirjas: automaatse sekvenaatoriga sekveneeritud DNA järjestus, mis saadakse automaatsest sekveneerimismasinast. Iga värv vastab ühele neljast alusest
Sangeri meetodi klassikalises versioonis toimib üks analüüsitud DNA ahelatest matriitsina komplementaarse ahela sünteesil ensüümi DNA polümeraasi poolt, seejärel sorteeritakse DNA fragmentide järjestus geelis suuruse järgi. Iga fragment, mis sünteesi käigus sisaldub DNA-s ja võimaldab reaktsioonisaaduste hilisemat visualiseerimist, märgistatakse terminaalsele alusele vastava fluorestseeruva värvainega (sellest oli juttu lk 124); seetõttu on selle fragmendi fluorestsents antud aluse identifikaator. Siis jääb üle vaid tuvastada ja reaktsiooniproduktid visualiseerida. Tulemusi analüüsitakse arvutiga ja esitatakse neljale nukleotiidile vastavate mitmevärviliste piikide järjestuses. Seejärel kantakse teave otse arvuti infosüsteemi, välistades aeganõudva ja kohati valuliku andmesisestusprotsessi, mis muutis järjestamise väga keeruliseks.
» Lisateavet raamatu kohta leiate aadressilt
»
»
Khabrozhiteley jaoks 25% allahindlus kupongi abil - PCR
Allikas: www.habr.com