Kary Mullis Kimikako Nobel saridun estatubatuarra Kalifornian hil zen, 74 urte zituela. Bere emaztearen arabera, heriotza abuztuaren 7an gertatu zen. Kausa bihotzeko eta arnas-gutxiegitasuna da pneumoniaren ondorioz.
James Watsonek berak, DNA molekularen aurkitzaileak, biokimikari egindako ekarpenaren berri emango digu eta horrengatik Nobel saria jaso zuen.
James Watson, Andrew Berry, Kevin Davisen liburuaren zatia
DNA. Iraultza genetikoaren historia
7. kapitulua. Giza genoma. Bizitzaren eszenatokia
...
Polimerasaren kate-erreakzioa (PCR) 1983an asmatu zuen Carey Mullis biokimikariak, Cetus-en lan egiten zuena. Erreakzio honen aurkikuntza nahiko nabarmena izan zen. Mullisek geroago gogoratu zuen: β1983ko apirileko ostiral arratsalde batean, epifania bat izan nuen. Bolantearen atzean nengoen, Kalifornia iparraldeko mendiko errepide bihurgunetsu eta ilargi argitsu batean behera, sekuoi basoen lurraldeanΒ». Ikusgarria da halako egoera batean inspirazioa jo izana. Eta ez da Kalifornia iparraldeak ezagutza sustatzen duten errepide bereziak dituenik; besterik ez da bere lagunak behin ikusi zuela Mullis zuhurtziarik gabe zihoala autobide izoztu batean zehar eta ez zuela batere molestatu. Lagun batek New York Times egunkariari esan zion: βMullisek sekuoi zuhaitz baten aurka talka eginda hilko zela ikusi zuen. Horregatik, ez dio ezeri beldurrik ematen gidatzen ari den bitartean, errepidean sekuoiak hazten ez badira behintzatΒ». Errepidean sekuoiak egoteak Mullis kontzentratzera behartu zuen eta... hemen zegoen, ikuspegi bat. Mullis-ek Kimikako Nobel Saria jaso zuen 1993an bere asmakizunagatik eta harrezkero are arrotz bihurtu da bere ekintzetan. Esaterako, HIESa GIBarekin zerikusirik ez duen teoria errebisionistaren aldekoa da, eta horrek bere ospea nabarmen ahuldu zuen eta medikuekin oztopatu zuen.
PCR nahiko erreakzio sinplea da. Hori gauzatzeko, beharrezkoa den DNA zatiaren kate ezberdinen aurkako muturretan osagarriak diren kimikoki sintetizatutako bi primer behar ditugu. Lehenak kate bakarreko DNAren atal laburrak dira, bakoitzak 20 base pare inguruko luzera du. Primeren berezitasuna da anplifikatu behar diren DNA sekzioei dagokiela, hau da, DNA txantiloiari.
(Irudia klikagarria) Kary Mullis, PCRren asmatzailea
PCRren espezifikotasuna txantiloiaren eta abiarazleen arteko konplexu osagarrien eraketan oinarritzen da, oligonukleotido sintetiko laburrak. Primer bakoitza kate bikoitzeko txantiloiaren kateetako baten osagarria da eta anplifikatutako eskualdearen hasiera eta amaiera mugatzen ditu. Izan ere, ondoriozko βmatrizeaβ genoma oso bat da, eta gure helburua interesatzen zaizkigun zatiak hortik isolatzea da. Horretarako, kate bikoitzeko DNA txantiloia 95 Β°C-ra berotzen da zenbait minutuz DNA kateak bereizteko. Etapa honi desnaturalizazioa deitzen zaio, bi DNA kateen arteko hidrogeno-loturak hausten direlako. Kateak banandu ondoren, tenperatura jaisten da, abiarazleak kate bakarreko txantiloiari lotu daitezen. DNA polimerasa DNAren erreplikazioa hasten du nukleotido-katearen zati bati lotuz. DNA polimerasa entzimak txantiloiaren katea errepikatzen du abiarazle edo kopiatzeko adibide gisa abiarazte bat erabiliz. Lehenengo zikloaren ondorioz, DNAren sekzio jakin baten bikoizketa sekuentzial anitz lortzen dugu. Ondoren, prozedura hau errepikatuko dugu. Ziklo bakoitzaren ostean xede-eremu bat lortzen dugu kantitate bikoitzean. Hogeita bost PCR zikloren ondoren (hau da, bi ordu baino gutxiagotan), guretzat interesgarria den DNA-eskualdea jatorrizkoa baino 225 aldiz handiagoa da (hau da, gutxi gorabehera 34 milioi aldiz handitu dugu). Izan ere, sarreran abiarazleen, ADN txantiloiaren, ADN polimerasa entzimaren eta A, C, G eta T base askeen nahasketa bat jaso genuen, erreakzio-produktu espezifiko baten kantitatea (abiarazleek mugatuta) esponentzialki hazten da eta kopurua. DNA kopia "luzea" lineala da, beraz, erreakzio produktuak nagusitzen dira.
Nahi den DNA atalaren anplifikazioa: polimerasaren kate erreakzioa
PCRaren hasierako garaietan, arazo nagusia honakoa zen: berotze-hozte ziklo bakoitzaren ondoren, DNA polimerasa gehitu behar zitzaion erreakzio-nahasteari, 95 ΒΊ C-ko tenperaturan inaktibatu baitzen. Horregatik, 25 zikloetako bakoitzaren aurretik berriro gehitzea beharrezkoa zen. Erreakzio-prozedura nahiko ez eraginkorra zen, denbora asko eta polimerasa entzima behar zuen, eta materiala oso garestia zen. Zorionez, Ama Natura erreskatatzera etorri zen. Animalia asko eroso sentitzen dira 37 Β°C-tik gorako tenperaturan. Zergatik bihurtu zen garrantzitsua guretzat 37 Β°C zifra? Hau gertatu zen tenperatura hori optimoa delako E. colirentzat, eta bertatik PCRrako polimerasa entzima lortu zen jatorriz. Naturan mikroorganismoak daude, zeinen proteinak, milioika urteko hautespen naturalean zehar, tenperatura altuekiko erresistenteagoak bihurtu diren. Bakterio termofiloetako DNA polimerasak erabiltzea proposatu da. Entzima hauek termoegonkorrak zirela eta erreakzio-ziklo asko jasateko gai izan ziren. Haien erabilerari esker, PCR sinplifikatzea eta automatizatzea ahalbidetu zuen. Lehen DNA polimerasa termoegonkorretako bat Yellowstone Parke Nazionaleko ur beroetan bizi den Thermus aquaticus bakteriotik isolatu zen eta Taq polimerasa izena jarri zioten.
PCR azkar bihurtu zen Giza Genoma Proiektuaren lan-zaldi. Orokorrean, prozesua ez da Mullis-ek garatutakoaren desberdina, automatizatu berri da. Jada ez ginen graduondoko ikasle ilun-multzo baten menpe, plastikozko saiakuntza-hodietan likido tantak neketsu isurtzen. Ikerketa genetiko molekularra egiten duten laborategi modernoetan, lan hau garraiatzaile robotikoetan egiten da. Giza Genoma bezain handia den sekuentziazio-proiektu batean parte hartzen duten PCR robotek etengabe lan egiten dute bero-egonkorra den polimerasa bolumen handiekin. Giza Genoma Proiektuan lanean ari diren zientzialari batzuk haserre zeuden PCR patentearen jabeak, Hoffmann-LaRoche farmazia-erraldoi industrial europarrak, kontsumigarrien kostuari gehitutako eskubide altuenengatik.
Beste "printzipio gidari" bat DNA sekuentziatzeko metodoa bera izan zen. Metodo honen oinarri kimikoa jada ez zen berria garai hartan: Interstate Human Genome Project (HGP) Fred Sangerrek 1970eko hamarkadaren erdialdean garatu zuen metodo burutsu bera hartu zuen. Berrikuntza sekuentziazioak lortu ahal izan zuen automatizazio mailan eta mailan zetzan.
Sekuentziazio automatikoa jatorriz Kaliforniako Teknologia Institutuko Lee Hooden laborategian garatu zen. Batxilergoa egin zuen Montanan eta unibertsitateko futbolean jokatu zuen quarterback gisa; Hoodi esker, taldeak behin baino gehiagotan irabazi zuen estatuko txapelketa. Bere karrera zientifikoan ere ondo etorri zitzaion talde-lanerako gaitasuna. Hood-en laborategia kimikari, biologo eta ingeniariez osatutako talde bitxi bat zegoen, eta bere laborategia laster bihurtu zen berrikuntza teknologikoan liderra.
Izan ere, sekuentziazio automatikoko metodoa Lloyd Smith eta Mike Hunkapiller-ek asmatu zuten. Mike Hunkapiller, orduan Hood-en laborategian lanean, Lloyd Smith-i hurbildu zitzaion sekuentziazio-metodo hobetu baten proposamen batekin, non oinarri mota bakoitza kolore ezberdina izango zen. Ideia horrek Sanger prozesuaren eraginkortasuna laukoiztu dezake. Sanger-en, lau hodietako bakoitzean sekuentziatzean (base kopuruaren arabera), DNA polimerasaren parte-hartzearekin, luzera ezberdineko oligonukleotidoen multzo berezia eratzen da, hasierako sekuentzia barne. Ondoren, formamida gehitu zitzaien katea bereizteko hodiei eta poliakrilamida gelaren elektroforesia egin zen lau bidetan. Smith eta Hunkapillerren bertsioan, didesoxinukleotidoak lau koloratzaile ezberdinekin markatzen dira eta PCR hodi batean egiten da. Ondoren, poliakrilamida gelaren elektroforesian, gelaren toki zehatz batean dagoen laser izpi batek koloratzaileen jarduera kitzikatzen du, eta detektagailuak zehazten du gelan zehar zein nukleotido migratzen ari den. Hasieran, Smith ezkorra zen; beldur zen koloratzaile dosi oso baxuak erabiltzeak nukleotidoen eskualdeak bereiztezin izatea ekarriko zuen. Hala ere, laser teknologiaren ulermen bikaina izanda, laster aurkitu zuen egoeratik irteteko koloratzaile fluorokromo bereziak erabiliz, laser erradiazioen eraginpean daudenean fluoreszentzen direnak.
(Bertsio osoa - 4,08 MB) Letra xehea: sekuentziatzaile automatiko baten bidez sekuentziatutako DNA sekuentzia, sekuentziazio automatikoko makina batetik lortua. Kolore bakoitza lau oinarrietako bati dagokio
Sanger metodoaren bertsio klasikoan, analizatutako DNAren kateetako batek DNA polimerasa entzimaren kate osagarri baten sintesirako txantiloi gisa jokatzen du, ondoren DNA zatien sekuentzia gel batean ordenatzen da tamainaren arabera. Sintesiaren garaian DNAn sartzen den eta erreakzio-produktuak gero bistaratzeko aukera ematen duen zati bakoitzari oinarri terminalari dagokion koloratzaile fluoreszente batekin markatzen da (hori jorratu zen 124. orrialdean); beraz, zati horren fluoreszentzia oinarri jakin baterako identifikatzaile bat izango da. Ondoren, detekzioa egitea eta erreakzio-produktuak bistaratzea besterik ez da geratzen. Emaitzak ordenagailuz aztertzen dira eta lau nukleotidori dagozkion kolore anitzeko gailurren sekuentzia gisa aurkezten dira. Ondoren, informazioa ordenagailuaren informazio sistemara zuzenean transferitzen da, sekuentziazioa oso zaila egiten zuen datuak sartzeko prozesu luzea eta batzuetan mingarria ezabatuz.
Β» Liburuari buruzko xehetasun gehiago hemen aurki daitezke
Β»
Β»
Khabrozhiteleyrentzat % 25eko deskontua kupoia erabiliz - PCR
Iturria: www.habr.com