کری مولیس، برنده آمریکایی جایزه نوبل شیمی، در سن ۷۴ سالگی در کالیفرنیا درگذشت. به گفته همسرش، مرگ در 74 آگوست رخ داده است. علت آن نارسایی قلبی و تنفسی ناشی از ذات الریه است.
خود جیمز واتسون، کاشف مولکول DNA، در مورد سهم خود در بیوشیمی و دریافت جایزه نوبل به ما خواهد گفت.
گزیده ای از کتاب جیمز واتسون، اندرو بری، کوین دیویس
DNA تاریخچه انقلاب ژنتیکی
فصل 7. ژنوم انسان. سناریوی زندگی
...
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در سال 1983 توسط بیوشیمیدان کری مولیس که در Cetus کار می کرد اختراع شد. کشف این واکنش کاملاً قابل توجه بود. مولیس بعداً به یاد آورد: «یک غروب جمعه در آوریل 1983، من یک عید عیسی داشتم. من پشت فرمان بودم و در جاده ای کوهستانی پر پیچ و خم و مهتابی در شمال کالیفرنیا، سرزمین جنگل های سرخ چوب، رانندگی می کردم. قابل توجه است که در چنین موقعیتی بود که الهام به او رسید. و این نیست که شمال کالیفرنیا جاده های خاصی دارد که بینش را ترویج می کند. فقط دوستش یک بار مولیس را دید که با سرعت بی احتیاطی در امتداد یک اتوبان دوگانه یخی در حال حرکت است و این اصلاً او را آزار نداد. یکی از دوستانش به نیویورک تایمز گفت: «مولیس این تصور را داشت که با برخورد به درخت قرمز می‌میرد. بنابراین هنگام رانندگی از هیچ چیز نمی ترسد، مگر اینکه درختان قرمز در کنار جاده روییده باشند.» وجود چوب‌های سرخ در کنار جاده، مولیس را مجبور به تمرکز کرد و... این یک بینش بود. مولیس برای اختراع خود در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد و از آن زمان در اقدامات خود حتی عجیب تر شد. به عنوان مثال، او از طرفداران نظریه تجدیدنظرطلب است که ایدز با HIV مرتبط نیست، که به طور قابل توجهی اعتبار خود را تضعیف کرد و پزشکان را مداخله کرد.
PCR یک واکنش نسبتاً ساده است. برای انجام آن، به دو آغازگر سنتز شده شیمیایی نیاز داریم که مکمل انتهای مخالف رشته‌های مختلف قطعه DNA مورد نیاز باشند. پرایمرها بخش های کوتاهی از DNA تک رشته ای هستند که طول هر کدام حدود 20 جفت باز است. ویژگی پرایمرها این است که آنها با بخش های DNA که باید تقویت شوند، یعنی الگوی DNA مطابقت دارند.
(قابل کلیک روی تصویر) کاری مولیس، مخترع PCR
ویژگی PCR بر اساس تشکیل کمپلکس های مکمل بین قالب و پرایمرها، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی کوتاه است. هر آغازگر مکمل یکی از رشته های قالب دو رشته ای است و ابتدا و انتهای ناحیه تقویت شده را محدود می کند. در واقع، "ماتریس" حاصل یک ژنوم کامل است و هدف ما جداسازی قطعات مورد علاقه ما از آن است. برای انجام این کار، الگوی DNA دو رشته ای به مدت چند دقیقه تا دمای 95 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود تا رشته های DNA از هم جدا شوند. این مرحله دناتوراسیون نامیده می شود زیرا پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته DNA شکسته شده است. پس از جدا شدن رشته ها، دما کاهش می یابد تا پرایمرها به قالب تک رشته ای متصل شوند. DNA پلیمراز همانندسازی DNA را با اتصال به یک زنجیره نوکلئوتیدی آغاز می کند. آنزیم DNA پلیمراز با استفاده از پرایمر به عنوان آغازگر یا نمونه ای برای کپی، رشته الگو را تکثیر می کند. در نتیجه چرخه اول، دو برابر شدن متوالی چندگانه یک بخش DNA خاص را به دست می آوریم. در مرحله بعد این روش را تکرار می کنیم. پس از هر چرخه، یک منطقه هدف را به مقدار دو برابر به دست می آوریم. پس از بیست و پنج سیکل PCR (یعنی در کمتر از دو ساعت)، ناحیه DNA مورد نظر خود را به مقدار 225 برابر بیشتر از نمونه اصلی داریم (یعنی تقریباً 34 میلیون بار آن را تقویت کرده ایم). در واقع، در ورودی مخلوطی از آغازگرها، DNA الگو، آنزیم DNA پلیمراز و بازهای آزاد A، C، G و T دریافت کردیم، مقدار یک محصول واکنش خاص (محدود شده توسط آغازگرها) به صورت تصاعدی رشد می کند و تعداد کپی های DNA "طولانی" خطی است، بنابراین در واکنش محصولات غالب است.
تقویت بخش DNA مورد نظر: واکنش زنجیره ای پلیمراز
در روزهای اولیه PCR، مشکل اصلی این بود: پس از هر چرخه گرمایش و خنک‌سازی، DNA پلیمراز باید به مخلوط واکنش اضافه می‌شد، زیرا در دمای 95 درجه سانتیگراد غیرفعال می‌شد. بنابراین لازم بود قبل از هر 25 سیکل مجدداً آن را اضافه کنید. روش واکنش نسبتا ناکارآمد بود، به زمان زیادی و آنزیم پلیمراز نیاز داشت و مواد بسیار گران بود. خوشبختانه مادر طبیعت به کمک آمد. بسیاری از حیوانات در دمای بسیار بالاتر از 37 درجه سانتیگراد احساس راحتی می کنند. چرا رقم 37 درجه سانتیگراد برای ما مهم شد؟ این به این دلیل اتفاق افتاد که این دما برای E. coli که آنزیم پلیمراز برای PCR در ابتدا از آن به دست آمد، بهینه است. در طبیعت میکروارگانیسم‌هایی وجود دارند که پروتئین‌های آنها طی میلیون‌ها سال انتخاب طبیعی، در برابر دماهای بالا مقاوم‌تر شده‌اند. پیشنهاد شده است که از DNA پلیمرازهای باکتری های گرمادوست استفاده شود. معلوم شد که این آنزیم ها در برابر حرارت پایدار هستند و می توانند چرخه های واکنش زیادی را تحمل کنند. استفاده از آنها امکان ساده سازی و خودکارسازی PCR را فراهم کرد. یکی از اولین DNA پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت از باکتری Thermus aquaticus که در چشمه های آب گرم پارک ملی یلوستون زندگی می کند جدا شد و Taq polymerase نام گرفت.
PCR به سرعت تبدیل به موتور اصلی پروژه ژنوم انسانی شد. به طور کلی، فرآیند هیچ تفاوتی با فرآیند توسعه یافته توسط Mullis ندارد، به تازگی خودکار شده است. ما دیگر به انبوهی از دانشجویان فارغ التحصیل کم هوش که با زحمت قطرات مایع را در لوله های آزمایش پلاستیکی می ریختند وابسته نبودیم. در آزمایشگاه های مدرن که تحقیقات ژنتیک مولکولی را انجام می دهند، این کار بر روی نوار نقاله های رباتیک انجام می شود. ربات‌های PCR درگیر در پروژه توالی‌یابی به بزرگی ژنوم انسان، بی‌وقفه با حجم عظیمی از پلیمراز پایدار در برابر حرارت کار می‌کنند. برخی از دانشمندانی که روی پروژه ژنوم انسانی کار می‌کردند، از حق‌الامتیازهای بالای غیرمنطقی که توسط صاحب پتنت PCR، غول دارویی صنعتی اروپایی هافمن-لاروش، به هزینه مواد مصرفی اضافه می‌شد، خشمگین شدند.
یکی دیگر از "اصل محرک" خود روش تعیین توالی DNA بود. اساس شیمیایی این روش دیگر در آن زمان جدید نبود: پروژه ژنوم انسانی بین ایالتی (HGP) همان روش مبتکرانه ای را که فرد سنگر در اواسط دهه 1970 توسعه داده بود، اتخاذ کرد. نوآوری در مقیاس و درجه اتوماسیونی بود که توالی یابی توانست به آن دست یابد.
توالی یابی خودکار در ابتدا در آزمایشگاه لی هود در موسسه فناوری کالیفرنیا توسعه یافت. او دبیرستان را در مونتانا گذراند و فوتبال کالج را به عنوان یک بازیکن مدافع بازی کرد. به لطف هود، این تیم بیش از یک بار قهرمان ایالت شد. مهارت های کار تیمی او نیز در حرفه علمی او مفید واقع شد. آزمایشگاه هود توسط گروهی متشکل از شیمیدانان، زیست شناسان و مهندسان کار می کرد و آزمایشگاه او به زودی به یک رهبر در نوآوری های تکنولوژیک تبدیل شد.
در واقع روش توالی خودکار توسط لوید اسمیت و مایک هانکاپیلر ابداع شد. مایک هانکاپیلر، که در آن زمان در آزمایشگاه هود کار می کرد، با پیشنهادی برای روش توالی یابی بهبودیافته که در آن هر نوع پایه به طور متفاوتی رنگ می شود، به لوید اسمیت نزدیک شد. چنین ایده ای می تواند کارایی فرآیند سنگر را چهار برابر کند. در سنگر، هنگام تعیین توالی در هر یک از چهار لوله (با توجه به تعداد باز)، با مشارکت DNA پلیمراز، مجموعه ای منحصر به فرد از اولیگونوکلئوتیدها با طول های مختلف، از جمله یک توالی آغازگر تشکیل می شود. سپس فرمامید برای جداسازی زنجیره به لوله ها اضافه شد و الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید در چهار لاین انجام شد. در نسخه اسمیت و هانکاپیلر، دی اکسی نوکلئوتیدها با چهار رنگ مختلف برچسب گذاری شده و PCR در یک لوله انجام می شود. سپس، در طول الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید، یک پرتو لیزر در یک مکان خاص روی ژل، فعالیت رنگ ها را تحریک می کند و آشکارساز تعیین می کند که کدام نوکلئوتید در حال حاضر از طریق ژل مهاجرت می کند. در ابتدا، اسمیت بدبین بود - او می ترسید که استفاده از دوزهای بسیار کم رنگ منجر به غیر قابل تشخیص بودن مناطق نوکلئوتیدی شود. با این حال، او با داشتن درک عالی از فناوری لیزر، به زودی با استفاده از رنگ‌های فلوئوروکروم خاصی که در معرض تابش لیزر فلورسانس می‌کنند، راهی برای خروج از این وضعیت پیدا کرد.
(نسخه کامل - 4,08 مگابایت) چاپ ریز: توالی DNA با استفاده از یک توالی سنجی خودکار، که از دستگاه توالی یابی خودکار به دست می آید، توالی یابی می شود. هر رنگ مربوط به یکی از چهار پایه است
در نسخه کلاسیک روش سانگر، یکی از رشته‌های DNA آنالیز شده به عنوان الگوی سنتز یک رشته مکمل توسط آنزیم DNA پلیمراز عمل می‌کند، سپس توالی قطعات DNA در یک ژل بر اساس اندازه مرتب می‌شوند. هر قطعه، که در طول سنتز در DNA گنجانده می شود و امکان تجسم بعدی محصولات واکنش را فراهم می کند، با یک رنگ فلورسنت مربوط به پایه پایانی برچسب گذاری می شود (این در صفحه 124 مورد بحث قرار گرفت). بنابراین، فلورسانس این قطعه یک شناسه برای یک پایه معین خواهد بود. سپس تنها چیزی که باقی می ماند این است که محصولات واکنش را شناسایی و تجسم کنیم. نتایج توسط کامپیوتر تجزیه و تحلیل شده و به عنوان دنباله ای از پیک های چند رنگ مربوط به چهار نوکلئوتید ارائه می شود. سپس اطلاعات مستقیماً به سیستم اطلاعات رایانه منتقل می شود و فرآیند ورود اطلاعات زمان بر و گاه دردناک را که توالی یابی را بسیار دشوار می کرد، حذف می کند.
» جزئیات بیشتر در مورد کتاب را می توانید در اینجا بیابید
»
»
برای Khabrozhiteley 25% تخفیف با استفاده از کوپن - PCR
منبع: www.habr.com