Amerikkalainen kemian Nobel-palkittu Kary Mullis kuoli Kaliforniassa 74-vuotiaana. Hänen vaimonsa mukaan kuolema tapahtui 7. elokuuta. Syynä on keuhkokuumeesta johtuva sydämen ja hengitysteiden vajaatoiminta.
James Watson itse, DNA-molekyylin löytäjä, kertoo panoksestaan biokemiassa ja mistä hän sai Nobel-palkinnon.
Ote James Watsonin, Andrew Berryn ja Kevin Davisin kirjasta
DNA. Geneettisen vallankumouksen historia
Luku 7. Ihmisen genomi. Elämän skenaario
...
Polymeraasiketjureaktion (PCR) keksi vuonna 1983 biokemisti Carey Mullis, joka työskenteli Cetuksella. Tämän reaktion löytö oli varsin merkittävä. Mullis muisteli myöhemmin: ”Eräänä perjantai-iltana huhtikuussa 1983 minulla oli loppiainen. Olin ratin takana ajamassa alas kuunvalaista, mutkaista vuoristotietä Pohjois-Kaliforniassa, punapuumetsien maassa.” On vaikuttavaa, että inspiraatio iski häneen juuri tällaisessa tilanteessa. Eikä kyse ole siitä, että Pohjois-Kaliforniassa on erityisiä teitä, jotka edistävät näkemystä; vain, että hänen ystävänsä näki kerran Mullisin kiihtyvän piittaamattomasti jäistä kaksirataallista tietä, eikä se häirinnyt häntä ollenkaan. Ystävä kertoi New York Timesille: ”Mullisilla oli visio, että hän kuolisi törmääessään punapuupuuhun. Siksi hän ei pelkää mitään ajaessaan, ellei tien varrella kasva männyä." Redwoods tien varrella pakotti Mullis keskittymään ja... tässä se oli, oivallus. Mullis sai Nobelin kemian palkinnon keksinnöstään vuonna 1993 ja on sittemmin muuttunut toimissaan entistäkin oudommaksi. Hän tukee esimerkiksi revisionistista teoriaa, jonka mukaan AIDS ei liity HIV:hen, mikä heikensi merkittävästi hänen omaa mainetta ja häiritsi lääkäreitä.
PCR on melko yksinkertainen reaktio. Sen suorittamiseksi tarvitsemme kaksi kemiallisesti syntetisoitua aluketta, jotka ovat komplementaarisia vaaditun DNA-fragmentin eri juosteiden vastakkaisille päille. Alukkeet ovat lyhyitä yksijuosteisen DNA:n osia, joista jokainen on noin 20 emäsparia pitkä. Alukkeiden erikoisuus on, että ne vastaavat DNA-osia, jotka on monistettava, eli DNA-templaattia.
(Kuva napsautettava) Kary Mullis, PCR:n keksijä
PCR:n spesifisyys perustuu komplementaaristen kompleksien muodostumiseen templaatin ja alukkeiden, lyhyiden synteettisten oligonukleotidien, välille. Jokainen aluke on komplementaarinen jollekin kaksijuosteisen templaatin säikeestä ja rajoittaa monistetun alueen alkua ja loppua. Itse asiassa tuloksena oleva "matriisi" on koko genomi, ja tavoitteemme on eristää meitä kiinnostavat fragmentit siitä. Tätä varten kaksijuosteinen DNA-templaatti kuumennetaan 95 °C:seen useiden minuuttien ajaksi DNA-säikeiden erottamiseksi. Tätä vaihetta kutsutaan denaturaatioksi, koska kahden DNA-juosteen väliset vetysidokset katkeavat. Kun säikeet ovat eronneet, lämpötilaa alennetaan, jotta alukkeet voivat sitoutua yksisäikeiseen mallineeseen. DNA-polymeraasi aloittaa DNA:n replikaation sitoutumalla nukleotidiketjun osaan. Entsyymi DNA-polymeraasi replikoi templaattijuosteen käyttämällä aluketta alukkeena tai esimerkkinä kopioimista varten. Ensimmäisen syklin tuloksena saamme tietyn DNA-osan moninkertaisen peräkkäisen tuplauksen. Seuraavaksi toistamme tämän menettelyn. Jokaisen syklin jälkeen saamme kohdealueen kaksinkertaisena määränä. Kahdenkymmenenviiden PCR-syklin jälkeen (eli alle kahdessa tunnissa) meillä on meitä kiinnostava DNA-alue 225 kertaa suurempi kuin alkuperäinen (eli olemme monistaneet sen noin 34 miljoonaa kertaa). Itse asiassa, sisääntulossa saimme seoksen alukkeita, templaatti-DNA:ta, DNA-polymeraasientsyymiä ja vapaita emäksiä A, C, G ja T, spesifisen reaktiotuotteen määrä (alukkeiden rajoittama) kasvaa eksponentiaalisesti ja määrä "pitkien" DNA-kopioiden määrä on lineaarinen, joten reaktiossa tuotteet hallitsevat.
Halutun DNA-osan monistaminen: polymeraasiketjureaktio
PCR:n alkuaikoina pääongelma oli seuraava: jokaisen kuumennus-jäähdytyssyklin jälkeen reaktioseokseen oli lisättävä DNA-polymeraasia, koska se inaktivoitiin 95 °C:n lämpötilassa. Siksi se oli tarpeen lisätä uudelleen ennen jokaista 25 sykliä. Reaktiomenetelmä oli suhteellisen tehoton, vaati paljon aikaa ja polymeraasientsyymiä, ja materiaali oli erittäin kallista. Onneksi luontoäiti tuli apuun. Monet eläimet viihtyvät paljon yli 37 °C:n lämpötiloissa. Miksi luvusta 37 °C tuli meille tärkeä? Tämä tapahtui, koska tämä lämpötila on optimaalinen E. colille, josta PCR:n polymeraasientsyymi alun perin saatiin. Luonnossa on mikro-organismeja, joiden proteiinit ovat miljoonien vuosien luonnonvalinnan aikana muuttuneet kestävämmiksi korkeita lämpötiloja vastaan. Termofiilisten bakteerien DNA-polymeraasien käyttöä on ehdotettu. Nämä entsyymit osoittautuivat lämpöstabiileiksi ja kestivät monia reaktiojaksoja. Niiden käyttö mahdollisti PCR:n yksinkertaistamisen ja automatisoinnin. Yksi ensimmäisistä lämpöstabiileista DNA-polymeraaseista eristettiin Thermus aquaticus -bakteerista, joka elää Yellowstonen kansallispuiston kuumissa lähteissä, ja nimettiin Taq-polymeraasiksi.
PCR:stä tuli nopeasti Human Genome Projectin työhevonen. Yleensä prosessi ei eroa Mullisin kehittämästä, se on juuri automatisoitu. Emme olleet enää riippuvaisia väkivaltaisten jatko-opiskelijoiden joukosta, joka kaateli vaivalloisesti nestepisaroita muovisiin koeputkiin. Nykyaikaisissa molekyyligeneettistä tutkimusta tekevissä laboratorioissa tämä työ suoritetaan robottikuljettimilla. Ihmisgenomia suuressa sekvensointiprojektissa mukana olevat PCR-robotit työskentelevät hellittämättä valtavien määrien lämpöstabiilia polymeraasia. Jotkut Human Genome Projectin parissa työskentelevät tutkijat olivat tyrmistyneet PCR-patentin omistajan, eurooppalaisen teollisuuslääkejättiläisen Hoffmann-LaRochen, kulutustavaroiden kustannuksiin lisäämistä kohtuuttoman korkeista rojalteista.
Toinen "ajoperiaate" oli itse DNA-sekvensointimenetelmä. Tämän menetelmän kemiallinen perusta ei ollut enää tuolloin uusi: Interstate Human Genome Project (HGP) otti käyttöön saman nerokkaan menetelmän, jonka Fred Sanger oli kehittänyt jo 1970-luvun puolivälissä. Innovaatio oli siinä laajuudessa ja automaatioasteessa, jonka sekvensointi pystyi saavuttamaan.
Automatisoitu sekvensointi kehitettiin alun perin Lee Hoodin laboratoriossa California Institute of Technologyssa. Hän osallistui lukioon Montanassa ja pelasi jalkapallon pelinrakentajana. Hoodin ansiosta joukkue voitti osavaltion mestaruuden useammin kuin kerran. Hänen ryhmätyötaitostaan oli myös hyötyä hänen tieteellisellä urallaan. Hoodin laboratoriossa työskenteli kirjava joukko kemistejä, biologeja ja insinöörejä, ja hänen laboratoriosta tuli pian teknologisen innovaation johtaja.
Itse asiassa automatisoidun sekvensointimenetelmän keksivät Lloyd Smith ja Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, joka työskenteli silloin Hoodin laboratoriossa, lähestyi Lloyd Smithiä ehdottaen parannettua sekvensointimenetelmää, jossa jokainen pohjatyyppi värjättäisiin eri tavalla. Tällainen ajatus voisi nelinkertaistaa Sanger-prosessin tehokkuuden. Sangerissa sekvensoitaessa jokaisessa neljästä putkesta (emästen lukumäärän mukaan) DNA-polymeraasin osallistuessa muodostuu ainutlaatuinen sarja eripituisia oligonukleotideja, mukaan lukien alukesekvenssi. Seuraavaksi putkiin lisättiin formamidia ketjun erottamiseksi ja polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin neljällä kaistalla. Smithin ja Hunkapillerin versiossa dideoksinukleotidit leimataan neljällä eri väriaineella ja PCR suoritetaan yhdessä putkessa. Sitten polyakryyliamidigeelielektroforeesin aikana lasersäde tietyssä geelin kohdassa herättää väriaineiden aktiivisuuden, ja ilmaisin määrittää, mikä nukleotidi kulkee parhaillaan geelin läpi. Aluksi Smith oli pessimistinen - hän pelkäsi, että erittäin alhaisten väriaineannosten käyttö johtaisi siihen, että nukleotidialueita ei voida erottaa. Hän kuitenkin ymmärsi erinomaisesti laserteknologian ja löysi pian tien ulos tilanteesta käyttämällä erityisiä fluorokromivärejä, jotka fluoresoivat joutuessaan alttiiksi lasersäteilylle.
(Täysversio - 4,08 MB) Hieno kirjoitus: automaattisella sekvensoijalla sekvensoitu DNA-sekvenssi, joka saadaan automaattisesta sekvensointikoneesta. Jokainen väri vastaa yhtä neljästä pohjasta
Sangerin menetelmän klassisessa versiossa yksi analysoidun DNA:n juosteista toimii templaattina komplementaarisen juosteen synteesiä varten DNA-polymeraasientsyymin toimesta, minkä jälkeen DNA-fragmenttien sekvenssi lajitellaan geelissä koon mukaan. Jokainen fragmentti, joka sisältyy DNA:han synteesin aikana ja mahdollistaa reaktiotuotteiden myöhemmän visualisoinnin, leimataan terminaalista emästä vastaavalla fluoresoivalla väriaineella (tätä käsiteltiin sivulla 124); siksi tämän fragmentin fluoresenssi on tietyn emäksen tunniste. Sitten on jäljellä vain havaitseminen ja reaktiotuotteiden visualisointi. Tulokset analysoidaan tietokoneella ja esitetään neljää nukleotidia vastaavien moniväristen piikkien sekvenssinä. Tiedot siirretään sitten suoraan tietokoneen tietojärjestelmään, jolloin vältytään aikaa vievältä ja joskus tuskalliselta tiedonsyöttöprosessilta, joka teki sekvensointia erittäin vaikeaksi.
» Lisätietoja kirjasta on osoitteessa
»
»
Khabrozhitelille 25% alennus kupongista - PCR
Lähde: will.com