En Californie, à l'âge de 74 ans, le lauréat américain du prix Nobel de chimie Carey Mullis est décédé. Selon sa femme, la mort est survenue le 7 août. La cause en est une insuffisance cardiaque et respiratoire due à une pneumonie.
James Watson, le découvreur de la molécule d'ADN, nous parlera de la contribution qu'il a apportée à la biochimie et des raisons pour lesquelles il a reçu le prix Nobel.
Extrait du livre de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis.
ADN. Histoire de la révolution génétique.
Chapitre 7. Le génome humain. Le scénario de la vie.
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La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été inventée en 1983 par le biochimiste Carey Mullis, qui travaillait pour la société Cetus. La découverte de cette réaction était très remarquable. Plus tard, Mullis se souvenait : « Un vendredi soir d'avril 1983, j'ai eu comme une illumination. Je conduisais, roulant sur une route de montagne sinueuse éclairée par la lune en Californie du Nord, près des forêts de séquoias. » Il est impressionnant que l'inspiration l'ait visité dans une telle situation. Et ce n'est pas que les routes du nord de la Californie favorisent l'illumination ; c'est juste qu'un de ses amis a un jour vu Mullis rouler de manière imprudente sur une route glacée à double sens, ce qui ne l'a absolument pas dérangé. Cet ami a raconté au New York Times : « Mullis a eu la vision qu'il allait mourir en percutant un séquoia. C'est pourquoi il n'a peur de rien au volant, tant qu'il n'y a pas de séquoias le long de la route. » La présence de séquoias le long de la route faisait que Mullis se concentrait et… voilà, l'illumination. Pour son invention, Mullis a reçu le prix Nobel de chimie en 1993 et est depuis devenu encore plus étrange dans ses actions. Par exemple, il est un partisan de la théorie révisionniste selon laquelle le sida n'est pas lié au VIH, ce qui a considérablement terni sa réputation et a nui aux médecins.
La PCR est une réaction assez simple. Pour la réaliser, nous avons besoin de deux amorces synthétisées chimiquement, complémentaires aux extrémités opposées de différentes chaînes du fragment d'ADN requis. Les amorces sont de courts segments d'ADN simple brin, chacun d'environ 20 paires de bases de long. La particularité des amorces est qu'elles correspondent aux segments d'ADN qui doivent être amplifiés, c'est-à-dire à la matrice d'ADN.
(L'image est cliquable) Kary Mullis, inventeur de la PCR
La spécificité de la PCR repose sur la formation de complexes complémentaires entre la matrice et les amorces, de courts oligonucléotides synthétiques. Chacune des amorces est complémentaire à l'une des chaînes de la matrice double-brin et limite le début et la fin de la région à amplifier. La « matrice » obtenue représente un génome entier et notre objectif est d'en extraire les fragments d'intérêt. Pour cela, la matrice d'ADN double-brin est chauffée à 95 °C pendant plusieurs minutes afin que les chaînes d'ADN se séparent. Cette étape est appelée dénaturation, car les liaisons hydrogène entre les deux chaînes d'ADN sont rompues. Lorsque les chaînes se sont séparées, la température est abaissée pour permettre aux amorces de se lier à la matrice simple-brin. L'ADN polymérase commence la réplication de l'ADN en se liant à un segment de la chaîne de nucléotides. L'enzyme ADN polymérase réplique la chaîne matricielle en utilisant l'amorce comme point de départ pour copier. À l'issue du premier cycle, nous obtenons un doublement successif d'une certaine région de l'ADN. Nous répétons ensuite cette procédure. Après chaque cycle, la région cible est doublée. Après vingt-cinq cycles de PCR (c'est-à-dire en moins de deux heures), nous avons la région d'ADN qui nous intéresse en quantité 225 fois supérieure à l'original (c'est-à-dire que nous l'avons amplifiée environ 34 millions de fois). En fait, à l'entrée, nous obtenons un mélange d'amorces, d'ADN matriciel, d'enzyme ADN polymérase et de bases libres A, C, G et T, la quantité de produit spécifique de la réaction (limitée par les amorces) augmente de manière exponentielle, tandis que le nombre de copies « longues » d'ADN augmente de manière linéaire, de sorte que les produits de la réaction dominent.
Amplification de la région d'ADN d'intérêt : réaction en chaîne par polymérase
Au début de l'utilisation de la PCR, le principal problème était que, après chaque cycle de chauffage-refroidissement, il fallait ajouter de la DNA polymérase à la solution réactionnelle, car elle était inactivée à une température de 95 °C. Il était donc nécessaire de la rajouter avant chacun des 25 cycles. La procédure de réaction était relativement inefficace, prenait beaucoup de temps et nécessitait un enzyme de polymérase, qui n'est pas bon marché. Heureusement, la nature est venue à notre secours. De nombreux animaux se sentent à l'aise à des températures bien supérieures à 37 °C. Pourquoi la température de 37 °C est-elle devenue si importante pour nous ? Cela s'explique par le fait que cette température est optimale pour l'E. coli, dont l'enzyme de polymérase utilisée pour la PCR était initialement dérivée. Dans la nature, il existe des microorganismes dont les protéines ont, au fil de millions d'années de sélection naturelle, devenues plus résistantes à des températures élevées. Il a été proposé d'utiliser des DNA polymérases provenant de bactéries thermophiles. Ces enzymes se sont avérées thermostables et pouvaient supporter de nombreux cycles de réaction. Leur utilisation a permis de simplifier et d'automatiser la PCR. L'une des premières DNA polymérases thermostables a été isolée à partir de la bactérie Thermus aquaticus, qui vit dans les sources chaudes du parc national de Yellowstone, et a été nommée polymérase Taq.
La PCR est rapidement devenue le principal cheval de bataille du projet « Génome humain ». En gros, le processus ne diffère pas de celui mis au point par Mullis, sauf qu'il a été automatisé. Nous ne dépendions plus d'une foule d'étudiants en thèse, versant laborieusement des gouttes de liquide dans des tubes en plastique. Dans les laboratoires modernes menant des recherches en génétique moléculaire, ce travail est effectué sur des chaînes de robots automatisées. Les robots PCR, engagés dans un projet d'une telle ampleur que le « Génome humain », travaillent inlassablement avec de grands volumes de polymérase thermorésistante. Certains scientifiques travaillant sur le projet « Génome humain » étaient indignés par les royalties excessives ajoutées au coût des matériaux, facturées par le détenteur du brevet de la PCR, le géant pharmaceutique et industriel européen Hoffmann-LaRoche.
Un autre « moteur » était la méthode même de séquençage de l'ADN. La base chimique de cette méthode n'était déjà plus une nouveauté à l'époque : le projet intergouvernemental « Génome humain » (HGP) a adopté la même méthode ingénieuse développée par Fred Sanger au milieu des années 1970. L'innovation résidait dans l'échelle et le degré d'automatisation qui ont pu être atteints lors du séquençage.
Le séquençage automatique a initialement été développé dans le laboratoire de Lee Hood au California Institute of Technology. Il a terminé ses études secondaires dans l'État du Montana et a joué au football américain au poste d'attaquant ; grâce à Hood, son équipe a remporté plusieurs fois le championnat de l'État. Ses compétences en travail d'équipe lui ont également été utiles dans sa carrière scientifique. Dans le laboratoire de Hood, une équipe variée de chimistes, biologistes et ingénieurs travaillait, et bientôt son laboratoire est devenu un leader en matière d'innovations technologiques.
En fait, la méthode de séquençage automatique a été inventée par Lloyd Smith et Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, qui travaillait alors au laboratoire de Hood, s'est tourné vers Lloyd Smith pour lui proposer une méthode de séquençage améliorée, où chaque type de base serait coloré différemment. Une telle idée pouvait quadrupler l'efficacité du processus de Sanger. Avec Sanger, lors du séquençage, un ensemble unique d'oligonucléotides de différentes longueurs se forme dans chacun des quatre tubes (correspondant aux quatre bases) grâce à l'ADN polymérase, incluant la séquence d'amorces. Ensuite, on ajoutait du formamide dans les tubes pour séparer les brins et on réalisait une électrophorèse dans un gel de polyacrylamide sur quatre pistes. Dans la version de Smith et Hunkapiller, les didésoxynucléotides étaient marqués avec quatre colorants différents et la PCR se déroulait dans un seul tube. Puis, lors de l'électrophorèse dans le gel de polyacrylamide, un faisceau laser à un endroit précis du gel excitait l'activité des colorants, et le détecteur identifiait quel nucléotide migrerait à ce moment à travers le gel. Au départ, Smith était pessimiste - il craignait que l'utilisation de doses extrêmement faibles de colorant entraîne des segments de nucléotides indiscernables. Cependant, expert en technologies laser, il trouva rapidement une solution en utilisant des colorants fluorochromes spéciaux qui fluorescent sous l'exposition du rayonnement laser.
(Version complète — 4,08 Mo) En petits caractères : séquence d'ADN déchiffrée à l'aide d'un séquenceur automatique, obtenue à partir d'un appareil de séquençage automatique. Chaque couleur correspond à une des quatre bases.
Dans la version classique de la méthode de Sanger, l'un des brins d'ADN analysés sert de matrice pour la synthèse d'un brin complémentaire par l'enzyme ADN polymérase, puis les fragments d'ADN sont triés dans un gel par taille. Chaque fragment inclus dans l'ADN lors de la synthèse et permettant de visualiser ultérieurement les produits de la réaction est marqué par un colorant fluorescent correspondant à la base terminale (cela a été mentionné à la p. 124) ; par conséquent, la fluorescence de ce fragment sera l'identifiant pour cette base. Il ne reste plus qu'à détecter et visualiser les produits de la réaction. Les résultats sont analysés à l'aide d'un ordinateur et présentés sous forme de séquence de pics colorés, correspondant aux quatre nucléotides. Ensuite, les informations sont directement transmises au système informatique, ce qui élimine le processus d'entrée de données, souvent long et parfois fastidieux, qui compliquait considérablement le séquençage.
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Source : habr.com
