{"id":37174,"date":"2019-10-31T22:16:11","date_gmt":"2019-10-31T19:16:11","guid":{"rendered":"https:\/\/prohoster.info\/blog\/umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk\/"},"modified":"2019-10-31T22:16:11","modified_gmt":"2019-10-31T19:16:11","slug":"umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/prohoster.info\/fr\/blog\/news\/umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk","title":{"rendered":"Le laur\u00e9at du prix Nobel Carey Mullis, inventeur de la r\u00e9action en cha\u00eene par polym\u00e9rase de l'ADN, est d\u00e9c\u00e9d\u00e9.","gt_translate_keys":[{"key":"rendered","format":"text"}]},"content":{"rendered":"

\"Le En Californie, \u00e0 l'\u00e2ge de 74 ans, le laur\u00e9at am\u00e9ricain du prix Nobel de chimie Carey Mullis est d\u00e9c\u00e9d\u00e9. Selon sa femme, la mort est survenue le 7 ao\u00fbt. La cause en est une insuffisance cardiaque et respiratoire due \u00e0 une pneumonie.<\/p>\n

James Watson, le d\u00e9couvreur de la mol\u00e9cule d'ADN, nous parlera de la contribution qu'il a apport\u00e9e \u00e0 la biochimie et des raisons pour lesquelles il a re\u00e7u le prix Nobel. <\/p>\n

Extrait du livre de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis. <\/p>\n

ADN. Histoire de la r\u00e9volution g\u00e9n\u00e9tique.<\/h2>\n

Chapitre 7. Le g\u00e9nome humain. Le sc\u00e9nario de la vie.<\/h3>\n

\n<\/a><\/noindex>
\n\u2026
\nLa r\u00e9action en cha\u00eene par polym\u00e9rase (PCR) a \u00e9t\u00e9 invent\u00e9e en 1983 par le biochimiste Carey Mullis, qui travaillait pour la soci\u00e9t\u00e9 Cetus. La d\u00e9couverte de cette r\u00e9action \u00e9tait tr\u00e8s remarquable. Plus tard, Mullis se souvenait : \u00ab Un vendredi soir d'avril 1983, j'ai eu comme une illumination. Je conduisais, roulant sur une route de montagne sinueuse \u00e9clair\u00e9e par la lune en Californie du Nord, pr\u00e8s des for\u00eats de s\u00e9quoias. \u00bb Il est impressionnant que l'inspiration l'ait visit\u00e9 dans une telle situation. Et ce n'est pas que les routes du nord de la Californie favorisent l'illumination ; c'est juste qu'un de ses amis a un jour vu Mullis rouler de mani\u00e8re imprudente sur une route glac\u00e9e \u00e0 double sens, ce qui ne l'a absolument pas d\u00e9rang\u00e9. Cet ami a racont\u00e9 au New York Times : \u00ab Mullis a eu la vision qu'il allait mourir en percutant un s\u00e9quoia. C'est pourquoi il n'a peur de rien au volant, tant qu'il n'y a pas de s\u00e9quoias le long de la route. \u00bb La pr\u00e9sence de s\u00e9quoias le long de la route faisait que Mullis se concentrait et\u2026 voil\u00e0, l'illumination. Pour son invention, Mullis a re\u00e7u le prix Nobel de chimie en 1993 et est depuis devenu encore plus \u00e9trange dans ses actions. Par exemple, il est un partisan de la th\u00e9orie r\u00e9visionniste selon laquelle le sida n'est pas li\u00e9 au VIH, ce qui a consid\u00e9rablement terni sa r\u00e9putation et a nui aux m\u00e9decins.<\/p>\n

La PCR est une r\u00e9action assez simple. Pour la r\u00e9aliser, nous avons besoin de deux amorces synth\u00e9tis\u00e9es chimiquement, compl\u00e9mentaires aux extr\u00e9mit\u00e9s oppos\u00e9es de diff\u00e9rentes cha\u00eenes du fragment d'ADN requis. Les amorces sont de courts segments d'ADN simple brin, chacun d'environ 20 paires de bases de long. La particularit\u00e9 des amorces est qu'elles correspondent aux segments d'ADN qui doivent \u00eatre amplifi\u00e9s, c'est-\u00e0-dire \u00e0 la matrice d'ADN. <\/p>\n

\"Le<\/a><\/noindex>
\n(L'image est cliquable) Kary Mullis, inventeur de la PCR<\/i><\/p>\n

La sp\u00e9cificit\u00e9 de la PCR repose sur la formation de complexes compl\u00e9mentaires entre la matrice et les amorces, de courts oligonucl\u00e9otides synth\u00e9tiques. Chacune des amorces est compl\u00e9mentaire \u00e0 l'une des cha\u00eenes de la matrice double-brin et limite le d\u00e9but et la fin de la r\u00e9gion \u00e0 amplifier. La \u00ab matrice \u00bb obtenue repr\u00e9sente un g\u00e9nome entier et notre objectif est d'en extraire les fragments d'int\u00e9r\u00eat. Pour cela, la matrice d'ADN double-brin est chauff\u00e9e \u00e0 95 \u00b0C pendant plusieurs minutes afin que les cha\u00eenes d'ADN se s\u00e9parent. Cette \u00e9tape est appel\u00e9e d\u00e9naturation, car les liaisons hydrog\u00e8ne entre les deux cha\u00eenes d'ADN sont rompues. Lorsque les cha\u00eenes se sont s\u00e9par\u00e9es, la temp\u00e9rature est abaiss\u00e9e pour permettre aux amorces de se lier \u00e0 la matrice simple-brin. L'ADN polym\u00e9rase commence la r\u00e9plication de l'ADN en se liant \u00e0 un segment de la cha\u00eene de nucl\u00e9otides. L'enzyme ADN polym\u00e9rase r\u00e9plique la cha\u00eene matricielle en utilisant l'amorce comme point de d\u00e9part pour copier. \u00c0 l'issue du premier cycle, nous obtenons un doublement successif d'une certaine r\u00e9gion de l'ADN. Nous r\u00e9p\u00e9tons ensuite cette proc\u00e9dure. Apr\u00e8s chaque cycle, la r\u00e9gion cible est doubl\u00e9e. Apr\u00e8s vingt-cinq cycles de PCR (c'est-\u00e0-dire en moins de deux heures), nous avons la r\u00e9gion d'ADN qui nous int\u00e9resse en quantit\u00e9 225 fois sup\u00e9rieure \u00e0 l'original (c'est-\u00e0-dire que nous l'avons amplifi\u00e9e environ 34 millions de fois). En fait, \u00e0 l'entr\u00e9e, nous obtenons un m\u00e9lange d'amorces, d'ADN matriciel, d'enzyme ADN polym\u00e9rase et de bases libres A, C, G et T, la quantit\u00e9 de produit sp\u00e9cifique de la r\u00e9action (limit\u00e9e par les amorces) augmente de mani\u00e8re exponentielle, tandis que le nombre de copies \u00ab longues \u00bb d'ADN augmente de mani\u00e8re lin\u00e9aire, de sorte que les produits de la r\u00e9action dominent.<\/p>\n

\"Le
\nAmplification de la r\u00e9gion d'ADN d'int\u00e9r\u00eat : r\u00e9action en cha\u00eene par polym\u00e9rase<\/i><\/p>\n

Au d\u00e9but de l'utilisation de la PCR, le principal probl\u00e8me \u00e9tait que, apr\u00e8s chaque cycle de chauffage-refroidissement, il fallait ajouter de la DNA polym\u00e9rase \u00e0 la solution r\u00e9actionnelle, car elle \u00e9tait inactiv\u00e9e \u00e0 une temp\u00e9rature de 95 \u00b0C. Il \u00e9tait donc n\u00e9cessaire de la rajouter avant chacun des 25 cycles. La proc\u00e9dure de r\u00e9action \u00e9tait relativement inefficace, prenait beaucoup de temps et n\u00e9cessitait un enzyme de polym\u00e9rase, qui n'est pas bon march\u00e9. Heureusement, la nature est venue \u00e0 notre secours. De nombreux animaux se sentent \u00e0 l'aise \u00e0 des temp\u00e9ratures bien sup\u00e9rieures \u00e0 37 \u00b0C. Pourquoi la temp\u00e9rature de 37 \u00b0C est-elle devenue si importante pour nous ? Cela s'explique par le fait que cette temp\u00e9rature est optimale pour l'E. coli, dont l'enzyme de polym\u00e9rase utilis\u00e9e pour la PCR \u00e9tait initialement d\u00e9riv\u00e9e. Dans la nature, il existe des microorganismes dont les prot\u00e9ines ont, au fil de millions d'ann\u00e9es de s\u00e9lection naturelle, devenues plus r\u00e9sistantes \u00e0 des temp\u00e9ratures \u00e9lev\u00e9es. Il a \u00e9t\u00e9 propos\u00e9 d'utiliser des DNA polym\u00e9rases provenant de bact\u00e9ries thermophiles. Ces enzymes se sont av\u00e9r\u00e9es thermostables et pouvaient supporter de nombreux cycles de r\u00e9action. Leur utilisation a permis de simplifier et d'automatiser la PCR. L'une des premi\u00e8res DNA polym\u00e9rases thermostables a \u00e9t\u00e9 isol\u00e9e \u00e0 partir de la bact\u00e9rie Thermus aquaticus, qui vit dans les sources chaudes du parc national de Yellowstone, et a \u00e9t\u00e9 nomm\u00e9e polym\u00e9rase Taq.<\/p>\n

La PCR est rapidement devenue le principal cheval de bataille du projet \u00ab G\u00e9nome humain \u00bb. En gros, le processus ne diff\u00e8re pas de celui mis au point par Mullis, sauf qu'il a \u00e9t\u00e9 automatis\u00e9. Nous ne d\u00e9pendions plus d'une foule d'\u00e9tudiants en th\u00e8se, versant laborieusement des gouttes de liquide dans des tubes en plastique. Dans les laboratoires modernes menant des recherches en g\u00e9n\u00e9tique mol\u00e9culaire, ce travail est effectu\u00e9 sur des cha\u00eenes de robots automatis\u00e9es. Les robots PCR, engag\u00e9s dans un projet d'une telle ampleur que le \u00ab G\u00e9nome humain \u00bb, travaillent inlassablement avec de grands volumes de polym\u00e9rase thermor\u00e9sistante. Certains scientifiques travaillant sur le projet \u00ab G\u00e9nome humain \u00bb \u00e9taient indign\u00e9s par les royalties excessives ajout\u00e9es au co\u00fbt des mat\u00e9riaux, factur\u00e9es par le d\u00e9tenteur du brevet de la PCR, le g\u00e9ant pharmaceutique et industriel europ\u00e9en Hoffmann-LaRoche.<\/p>\n

Un autre \u00ab moteur \u00bb \u00e9tait la m\u00e9thode m\u00eame de s\u00e9quen\u00e7age de l'ADN. La base chimique de cette m\u00e9thode n'\u00e9tait d\u00e9j\u00e0 plus une nouveaut\u00e9 \u00e0 l'\u00e9poque : le projet intergouvernemental \u00ab G\u00e9nome humain \u00bb (HGP) a adopt\u00e9 la m\u00eame m\u00e9thode ing\u00e9nieuse d\u00e9velopp\u00e9e par Fred Sanger au milieu des ann\u00e9es 1970. L'innovation r\u00e9sidait dans l'\u00e9chelle et le degr\u00e9 d'automatisation qui ont pu \u00eatre atteints lors du s\u00e9quen\u00e7age.<\/p>\n

Le s\u00e9quen\u00e7age automatique a initialement \u00e9t\u00e9 d\u00e9velopp\u00e9 dans le laboratoire de Lee Hood au California Institute of Technology. Il a termin\u00e9 ses \u00e9tudes secondaires dans l'\u00c9tat du Montana et a jou\u00e9 au football am\u00e9ricain au poste d'attaquant ; gr\u00e2ce \u00e0 Hood, son \u00e9quipe a remport\u00e9 plusieurs fois le championnat de l'\u00c9tat. Ses comp\u00e9tences en travail d'\u00e9quipe lui ont \u00e9galement \u00e9t\u00e9 utiles dans sa carri\u00e8re scientifique. Dans le laboratoire de Hood, une \u00e9quipe vari\u00e9e de chimistes, biologistes et ing\u00e9nieurs travaillait, et bient\u00f4t son laboratoire est devenu un leader en mati\u00e8re d'innovations technologiques.<\/p>\n

En fait, la m\u00e9thode de s\u00e9quen\u00e7age automatique a \u00e9t\u00e9 invent\u00e9e par Lloyd Smith et Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, qui travaillait alors au laboratoire de Hood, s'est tourn\u00e9 vers Lloyd Smith pour lui proposer une m\u00e9thode de s\u00e9quen\u00e7age am\u00e9lior\u00e9e, o\u00f9 chaque type de base serait color\u00e9 diff\u00e9remment. Une telle id\u00e9e pouvait quadrupler l'efficacit\u00e9 du processus de Sanger. Avec Sanger, lors du s\u00e9quen\u00e7age, un ensemble unique d'oligonucl\u00e9otides de diff\u00e9rentes longueurs se forme dans chacun des quatre tubes (correspondant aux quatre bases) gr\u00e2ce \u00e0 l'ADN polym\u00e9rase, incluant la s\u00e9quence d'amorces. Ensuite, on ajoutait du formamide dans les tubes pour s\u00e9parer les brins et on r\u00e9alisait une \u00e9lectrophor\u00e8se dans un gel de polyacrylamide sur quatre pistes. Dans la version de Smith et Hunkapiller, les did\u00e9soxynucl\u00e9otides \u00e9taient marqu\u00e9s avec quatre colorants diff\u00e9rents et la PCR se d\u00e9roulait dans un seul tube. Puis, lors de l'\u00e9lectrophor\u00e8se dans le gel de polyacrylamide, un faisceau laser \u00e0 un endroit pr\u00e9cis du gel excitait l'activit\u00e9 des colorants, et le d\u00e9tecteur identifiait quel nucl\u00e9otide migrerait \u00e0 ce moment \u00e0 travers le gel. Au d\u00e9part, Smith \u00e9tait pessimiste - il craignait que l'utilisation de doses extr\u00eamement faibles de colorant entra\u00eene des segments de nucl\u00e9otides indiscernables. Cependant, expert en technologies laser, il trouva rapidement une solution en utilisant des colorants fluorochromes sp\u00e9ciaux qui fluorescent sous l'exposition du rayonnement laser.<\/p>\n

\"Le
\n(Version compl\u00e8te au clic<\/a><\/noindex> \u2014 4,08 Mo) En petits caract\u00e8res : s\u00e9quence d'ADN d\u00e9chiffr\u00e9e \u00e0 l'aide d'un s\u00e9quenceur automatique, obtenue \u00e0 partir d'un appareil de s\u00e9quen\u00e7age automatique. Chaque couleur correspond \u00e0 une des quatre bases.<\/i> <\/p>\n

Dans la version classique de la m\u00e9thode de Sanger, l'un des brins d'ADN analys\u00e9s sert de matrice pour la synth\u00e8se d'un brin compl\u00e9mentaire par l'enzyme ADN polym\u00e9rase, puis les fragments d'ADN sont tri\u00e9s dans un gel par taille. Chaque fragment inclus dans l'ADN lors de la synth\u00e8se et permettant de visualiser ult\u00e9rieurement les produits de la r\u00e9action est marqu\u00e9 par un colorant fluorescent correspondant \u00e0 la base terminale (cela a \u00e9t\u00e9 mentionn\u00e9 \u00e0 la p. 124) ; par cons\u00e9quent, la fluorescence de ce fragment sera l'identifiant pour cette base. Il ne reste plus qu'\u00e0 d\u00e9tecter et visualiser les produits de la r\u00e9action. Les r\u00e9sultats sont analys\u00e9s \u00e0 l'aide d'un ordinateur et pr\u00e9sent\u00e9s sous forme de s\u00e9quence de pics color\u00e9s, correspondant aux quatre nucl\u00e9otides. Ensuite, les informations sont directement transmises au syst\u00e8me informatique, ce qui \u00e9limine le processus d'entr\u00e9e de donn\u00e9es, souvent long et parfois fastidieux, qui compliquait consid\u00e9rablement le s\u00e9quen\u00e7age.<\/p>\n

\u00bb Pour plus de d\u00e9tails sur le livre, vous pouvez consulter le site de l'\u00e9diteur<\/a><\/noindex>
\n\u00bb Table des mati\u00e8res<\/a><\/noindex>
\n\u00bb Extrait<\/a><\/noindex><\/p>\n

Pour les membres de Habr, une remise de 25 % avec le code promotionnel \u2014 PCR<\/b>
\n
Source : habr.com<\/a><\/p>","protected":false,"gt_translate_keys":[{"key":"rendered","format":"html"}]},"excerpt":{"rendered":"

\u0412 \u041a\u0430\u043b\u0438\u0444\u043e\u0440\u043d\u0438\u0438 \u0432 \u0432\u043e\u0437\u0440\u0430\u0441\u0442\u0435 74 \u043b\u0435\u0442 \u0443\u043c\u0435\u0440 \u0430\u043c\u0435\u0440\u0438\u043a\u0430\u043d\u0441\u043a\u0438\u0439 \u043d\u043e\u0431\u0435\u043b\u0435\u0432\u0441\u043a\u0438\u0439 \u043b\u0430\u0443\u0440\u0435\u0430\u0442 \u043f\u043e \u0445\u0438\u043c\u0438\u0438 \u041a\u044d\u0440\u0438 \u041c\u0443\u043b\u043b\u0438\u0441. \u041f\u043e \u0441\u043b\u043e\u0432\u0430\u043c \u0435\u0433\u043e \u0441\u0443\u043f\u0440\u0443\u0433\u0438, \u0441\u043c\u0435\u0440\u0442\u044c \u043d\u0430\u0441\u0442\u0443\u043f\u0438\u043b\u0430 7 \u0430\u0432\u0433\u0443\u0441\u0442\u0430. \u041f\u0440\u0438\u0447\u0438\u043d\u0430 \u2014 \u0441\u0435\u0440\u0434\u0435\u0447\u043d\u0430\u044f \u0438 \u0434\u044b\u0445\u0430\u0442\u0435\u043b\u044c\u043d\u0430\u044f \u043d\u0435\u0434\u043e\u0441\u0442\u0430\u0442\u043e\u0447\u043d\u043e\u0441\u0442\u044c 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