De Amerikaanske Nobelpriiswinner yn de skiekunde Kary Mullis ferstoar yn Kalifornje yn 'e âldens fan 74. Neffens syn frou barde de dea op 7 augustus. De oarsaak is hert- en respiratory failure troch pneumony.
James Watson sels, de ûntdekker fan it DNA-molekule, sil ús fertelle oer syn bydrage oan de biogemy en wêrfoar hy de Nobelpriis krige.
Fragmint út it boek fan James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Skiednis fan 'e Genetyske Revolúsje
Haadstik 7. Minsklike genome. Life senario
...
De polymeraseketenreaksje (PCR) waard yn 1983 útfûn troch biochemist Carey Mullis, dy't wurke by Cetus. De ûntdekking fan dizze reaksje wie hiel opmerklik. Mullis herinnerde letter: "Op freedtejûn yn april 1983 hie ik in epifany. Ik siet achter it stjoer, ried del in moanneljochte, kronkeljende berchwei yn Noard-Kalifornje, it lân fan 'e redwoodbosken. It is yndrukwekkend dat it yn sa'n situaasje wie dat ynspiraasje him opfoel. En it is net dat noardlik Kalifornje spesjale diken hat dy't ynsjoch befoarderje; it is krekt dat syn freon Mullis ienris roekeleas oer in iiskâlde dûbele rydbaan riden seach en it hie him neat oan. In freon fertelde de New York Times: "Mullis hie in fyzje dat hy soe stjerre troch te botsjen yn in redwoodbeam. Dêrom is er by it riden neat bang foar, útsein as der redwoodbeammen lâns de dyk groeie.” De oanwêzigens fan redwoods lâns de dyk twong Mullis om te konsintrearjen en ... hjir wie it, in ynsjoch. Mullis krige de Nobelpriis foar Skiekunde foar syn útfining yn 1993 en is sûnt noch frjemder wurden yn syn dieden. Bygelyks, hy is in oanhinger fan 'e revisionistyske teory dat AIDS net besibbe is oan HIV, dy't syn eigen reputaasje signifikant ûndermine en dokters bemuoie.
PCR is in frij ienfâldige reaksje. Om it út te fieren, hawwe wy twa gemysk synthesisearre primers nedich dy't komplemintêr binne oan 'e tsjinoerstelde úteinen fan ferskate stringen fan it fereaske DNA-fragmint. Primers binne koarte seksjes fan ienstrengige DNA, elk sawat 20 basepearen yn 'e lingte. De eigenaardichheid fan primers is dat se oerienkomme mei de DNA-seksjes dy't moatte wurde fersterke, dat is it DNA-sjabloan.
(Ofbylding te klikken) Kary Mullis, útfiner fan PCR
De spesifisiteit fan PCR is basearre op de formaasje fan komplementêre kompleksen tusken it sjabloan en primers, koarte syntetyske oligonucleotides. Elke primer is komplemintêr foar ien fan 'e stringen fan' e dûbelstrengige sjabloan en beheint it begjin en ein fan 'e fersterke regio. Yn feite is de resultearjende "matrix" in hiele genoom, en ús doel is om de fragminten fan belang foar ús út te isolearjen. Om dit te dwaan, wurdt it dûbelstrengige DNA-sjabloan ferskate minuten ferwaarme oant 95 °C om de DNA-strengen te skieden. Dit poadium wurdt denaturaasje neamd, om't de wetterstofbânen tusken de twa DNA-strengen brutsen binne. As de stringen ienris skieden binne, wurdt de temperatuer ferlege om de primers te ferbinen oan it single-stranded sjabloan. DNA-polymerase begjint DNA-replikaasje troch te binen oan in stik fan nukleotideketen. It enzym DNA-polymerase replicates de sjabloanstreng mei in primer as primer as foarbyld foar kopiearjen. As gefolch fan 'e earste syklus krije wy meardere opfolgjende ferdûbeling fan in bepaalde DNA-seksje. Dan werhelje wy dizze proseduere. Nei elke syklus krije wy in doelgebiet yn dûbele kwantiteit. Nei fiifentweintich PCR-syklusen (dat is yn minder dan twa oeren), hawwe wy de DNA-regio fan belang foar ús yn in bedrach 225 kear heger as it orizjineel (dat is, wy hawwe it sawat 34 miljoen kear fersterke). Yn feite krigen wy by de ynfier in mingsel fan primers, sjabloan-DNA, it DNA-polymerase-enzyme en frije basen A, C, G en T, it bedrach fan in spesifyk reaksjeprodukt (beheind troch de primers) groeit eksponentiell, en it oantal fan "lange" DNA kopyen is lineêr, dus yn reaksje produkten dominearret.
Amplifikaasje fan 'e winske DNA-seksje: polymeraseketenreaksje
Yn 'e iere dagen fan PCR wie it haadprobleem it folgjende: nei elke ferwaarming-koelingssyklus moast DNA-polymerase tafoege wurde oan it reaksjegemik, om't it ynaktivearre waard by in temperatuer fan 95 ° C. Dêrom wie it nedich om it opnij te foegjen foar elk fan 'e 25 syklusen. De reaksjeproseduere wie relatyf net effisjint, easke in protte tiid en it polymerase-enzyme, en it materiaal wie tige djoer. Lokkich kaam Mem Natuer te rêden. In protte bisten fiele har noflik by temperatueren folle heger as 37 °C. Wêrom is it sifer 37 °C wichtich foar ús wurden? Dat barde om't dizze temperatuer optimaal is foar E. coli, dêr't oarspronklik it polymerase-enzyme foar PCR út helle is. Yn de natuer binne d'r mikro-organismen wêrfan de aaiwiten, oer miljoenen jierren fan natuerlike seleksje, mear resistint wurden binne foar hege temperatueren. It is foarsteld om DNA-polymerasen te brûken fan thermofilyske baktearjes. Dizze enzymen bliken thermostabyl te wêzen en koenen in protte reaksjesyklusen ferneare. Har gebrûk makke it mooglik om PCR te ferienfâldigjen en te automatisearjen. Ien fan 'e earste thermostabile DNA-polymerasen waard isolearre út 'e baktearje Thermus aquaticus, dy't libbet yn 'e waarme boarnen fan it Nasjonaal Park Yellowstone, en waard Taq polymerase neamd.
PCR waard fluch it wurkhynder fan it Human Genome Project. Yn 't algemien is it proses net oars as it troch Mullis ûntwikkele, it is krekt automatisearre. Wy wiene net langer ôfhinklik fan in mannichte fan dimmene ôfstudearden dy't mei soarch dripkes floeistof yn plestik reagearbuizen gienen. Yn moderne laboratoaria dy't molekulêr genetysk ûndersyk útfiere, wurdt dit wurk útfierd op robotyske transportbanden. PCR-robots belutsen by in sequencing-projekt sa grut as it Human Genome wurkje relentlessly mei enoarme folumes fan waarmtestabile polymerase. Guon wittenskippers dy't wurken oan it Human Genome Project wiene fergriemd troch de ûnferstannich hege royalty's tafoege oan de kosten fan verbruiksartikelen troch de eigner fan it PCR-patint, de Jeropeeske yndustriële farmaseutyske reus Hoffmann-LaRoche.
In oar "driuwende prinsipe" wie de metoade foar DNA-sekwinsje sels. De gemyske basis fan dizze metoade wie doe net mear nij: it Interstate Human Genome Project (HGP) naam deselde geniale metoade oan dy't Fred Sanger yn 'e midden fan 'e jierren '1970 ûntwikkele hie. De ynnovaasje lei yn 'e skaal en graad fan automatisearring dy't sequencing berikke koe.
Automatisearre sequencing waard oarspronklik ûntwikkele yn Lee Hood's laboratoarium oan it California Institute of Technology. Hy folge de middelbere skoalle yn Montana en spile college fuotbal as quarterback; Mei tank oan Hood wûn it team it steatskampioenskip mear as ien kear. Syn teamwurkfeardigens kaam ek goed fan pas yn syn wittenskiplike karriêre. Hood syn laboratoarium waard bemanne troch in bonte bemanning fan skiekundigen, biologen en yngenieurs, en syn laboratoarium waard al gau in lieder yn technologyske ynnovaasje.
Yn feite, de automatyske sequencing metoade waard útfûn troch Lloyd Smith en Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, doe wurke yn it laboratoarium fan Hood, benadere Lloyd Smith mei in foarstel foar in ferbettere sekwinsjemetoade wêrby't elk type basis oars kleure soe. Sa'n idee kin de effisjinsje fan it Sanger-proses ferfjouwerfâldigje. Yn Sanger, by sequencing yn elk fan fjouwer buizen (neffens it oantal basen), mei de dielname fan DNA-polymerase, wurdt in unike set fan oligonucleotides fan ferskillende lingten foarme, ynklusyf in primer-sekwinsje. Folgjende, formamide waard tafoege oan de buizen foar keten skieding en polyacrylamide gel electrophoresis waard útfierd op fjouwer banen. Yn 'e ferzje fan Smith en Hunkapiller wurde dideoxynucleotides markearre mei fjouwer ferskillende kleurstoffen en PCR wurdt útfierd yn ien buis. Dan, tidens polyacrylamide-gelelektroforese, stimulearret in laserstraal op in spesifike lokaasje op 'e gel de aktiviteit fan' e kleurstoffen, en de detektor bepaalt hokker nukleotide op it stuit troch de gel migreart. Yn it earstoan wie Smith pessimistysk - hy benaude dat it brûken fan ultra-lege doses kleurstof der ta soe liede dat de nukleotideregio's net te ûnderskieden wiene. Lykwols, it hawwen fan in treflik begryp fan laser technology, hy fûn al gau in útwei út 'e situaasje troch it brûken fan spesjale fluorochrome kleurstoffen dy't fluoresce doe't bleatsteld oan laser strieling.
(Folsleine ferzje - 4,08 MB) Fine print: DNA-sekwinsje foldien mei in automatyske sequencer, krigen fan in automatyske sequencing-masine. Elke kleur komt oerien mei ien fan fjouwer bases
Yn 'e klassike ferzje fan' e Sanger-metoade fungearret ien fan 'e stringen fan' e analysearre DNA as sjabloan foar de synteze fan in komplemintêre strân troch it enzyme DNA-polymerase, dan wurdt de folchoarder fan DNA-fragminten yn in gel troch grutte sortearre. Elts fragmint, dat is opnaam yn 'e DNA tidens synteze en lit folgjende fisualisaasje fan reaksje produkten, is bestimpele mei in fluorescent kleurstof oerienkomt mei de terminal basis (dit waard besprutsen op p. 124); dêrom, de fluorescence fan dit fragmint sil wêze in identifier foar in opjûne basis. Dan bliuwt alles oer om deteksje út te fieren en de reaksjeprodukten te visualisearjen. De resultaten wurde analysearre troch kompjûter en presintearre as in folchoarder fan multi-coloured peaks oerienkommende mei fjouwer nucleotides. De ynformaasje wurdt dan direkt oerbrocht nei it ynformaasjesysteem fan 'e kompjûter, wêrtroch't it tiidslinende en soms pynlike gegevensynfierproses elimineert dat sequencing heul lestich makke.
» Mear details oer it boek is te finen op
»
»
Foar Khabrozhiteley 25% koarting mei coupon - PCR
Boarne: www.habr.com