Bhàsaich Kary Mullis, labhraiche Nobel Ameireaganach ann an Ceimigeachd, ann an California aig aois 74. A rèir a bhean, thachair bàs air 7 Lùnastal. Is e an adhbhar fàilligeadh cridhe agus analach mar thoradh air neumonia.
Innsidh Seumas MacBhàtair fhèin, a lorg am moileciuil DNA, dhuinn mu na chuir e ri bith-cheimigeachd agus air an do choisinn e an Duais Nobel.
Earrann às an leabhar le Seumas MacBhàtair, Anndra Berry, Kevin Davis
DNA. Eachdraidh an Ar-a-mach Ginteil
Caibideil 7. Genome daonna. Sgeama beatha
...
Chaidh am freagairt slabhraidh polymerase (PCR) a chruthachadh ann an 1983 leis an bith-cheimigear Carey Mullis, a bha ag obair aig Cetus. Bha lorg an fhreagairt seo gu math iongantach. Chuimhnich Mullis às deidh sin: “Aon oidhche Haoine sa Ghiblean 1983, bha epiphany agam. Bha mi air cùl na cuibhle, a’ draibheadh sìos rathad beinne le solas gealaich ann an ceann a tuath California, tìr nan coilltean dearg.” Tha e iongantach gur ann ann an suidheachadh mar sin a thug brosnachadh dha. Agus chan e gu bheil rathaidean sònraichte aig ceann a tuath California a bhrosnaicheas lèirsinn; is e dìreach gu robh a charaid uaireigin a’ faicinn Mullis a’ ruith gu neo-chùramach air rathad dùbailte reòta agus cha do chuir sin dragh sam bith air. Thuirt caraid ris an New York Times: “Bha sealladh aig Mullis gum bàsaicheadh e le bhith a’ bualadh air craobh dearg. Mar sin, chan eil eagal air ro rud sam bith fhad ‘s a tha e a’ draibheadh, mura h-eil craobhan dearga a’ fàs air an rathad.” Thug làthaireachd choilltean dearga air an rathad air Mullis cuimseachadh agus... seo e, sealladh. Fhuair Mullis an Duais Nobel ann an Ceimigeachd airson an innleachd aige ann an 1993 agus bhon uair sin tha e air a bhith eadhon nas coigreach na ghnìomhan. Mar eisimpleir, tha e na neach-taic do theòiridh an ath-sgrùdaiche nach eil AIDS co-cheangailte ri HIV, a chuir gu mòr an aghaidh a chliù fhèin agus a chuir bacadh air dotairean.
Tha PCR na fhreagairt gu math sìmplidh. Gus a dhèanamh, feumaidh sinn dà phrìomhairear ceimigeach air an co-chur gu ceimigeach a tha a 'cur ri cinn eile diofar iallan den chriomag DNA a tha a dhìth. Is e earrannan goirid de DNA aon-shreath a th’ ann am primearan, gach fear mu 20 paidhir bhunaiteach de dh’fhaid. Is e cho sònraichte ‘s a tha primers gu bheil iad a’ freagairt ris na h-earrannan DNA a dh’ fheumar a mheudachadh, is e sin, an teamplaid DNA.
(Ìomhaigh ri fhaicinn) Kary Mullis, innleadair PCR
Tha sònrachas PCR stèidhichte air cruthachadh iom-fhilltean co-phàirteach eadar an teamplaid agus na primers, oligonucleotides goirid synthetigeach. Tha gach aon de na primers a 'cur ri aon de na sreathan den teamplaid le dà shreath agus a' cuingealachadh toiseach is deireadh na roinne leudaichte. Gu dearbh, tha an “matrix” a tha mar thoradh air sin na genoma slàn, agus is e ar n-amas na pìosan anns a bheil ùidh againn a sgaradh bhuaithe. Gus seo a dhèanamh, tha an teamplaid DNA dà-shreath air a theasachadh gu 95 ° C airson grunn mhionaidean gus na sreathan DNA a sgaradh. Canar dì-nàdarachadh ris an ìre seo oir tha na ceanglaichean hydrogen eadar an dà shreath DNA briste. Aon uair ‘s gu bheil na dualan air dealachadh, tha an teòthachd air a lughdachadh gus leigeil leis na primers ceangal ris an teamplaid aon-shreath. Bidh DNA polymerase a’ tòiseachadh mac-samhail DNA le bhith a’ ceangal ri sreath de shlabhraidh nucleotide. Bidh an enzyme DNA polymerase ag ath-aithris an dualan teamplaid a’ cleachdadh primer mar primer no eisimpleir airson leth-bhreac. Mar thoradh air a’ chiad chearcall, gheibh sinn dùblachadh ioma-sheòrsach de roinn DNA sònraichte. An uairsin bidh sinn ag ath-aithris a 'mhodh-obrachaidh seo. Às deidh gach cearcall gheibh sinn raon targaid ann an meud dùbailte. Às deidh còig cuairtean fichead PCR (is e sin, ann an nas lugha na dà uair a thìde), tha an roinn DNA inntinneach dhuinn ann an suim 225 uair nas àirde na an tè tùsail (is e sin, tha sinn air a mheudachadh timcheall air 34 millean uair). Gu dearbh, aig an cuir a-steach fhuair sinn measgachadh de primers, teamplaid DNA, an enzyme DNA polymerase agus bunaitean an-asgaidh A, C, G agus T, bidh an ìre de thoradh ath-bhualadh sònraichte (cuibhrichte leis na primers) a ’fàs gu h-obann, agus tha an àireamh Tha leth-bhreacan DNA “fada” sreathach, agus mar sin ann am bathar freagairt tha làmh an uachdair.
Meudachadh air an roinn DNA a tha thu ag iarraidh: freagairt slabhraidh polymerase
Ann an làithean tràtha PCR, b 'e am prìomh dhuilgheadas na leanas: às deidh gach cearcall teasachaidh-fuarachadh, dh'fheumadh DNA polymerase a bhith air a chur ris a' mheasgachadh ath-fhreagairt, oir chaidh a chur an gnìomh aig teòthachd 95 ° C. Mar sin, bha e riatanach a chur ris a-rithist ro gach aon de na 25 cuairtean. Bha am modh ath-bhualadh an ìre mhath neo-èifeachdach, feumach air tòrr ùine agus an enzyme polymerase, agus bha an stuth gu math daor. Gu fortanach, thàinig Mother Nature gu teasairginn. Bidh mòran bheathaichean a’ faireachdainn comhfhurtail aig teòthachd mòran nas àirde na 37 ° C. Carson a thàinig am figear 37 °C gu bhith cudromach dhuinn? Thachair seo leis gu bheil an teòthachd seo as fheàrr airson E. coli, às an deach an enzyme polymerase airson PCR fhaighinn bho thùs. Ann an nàdar tha meanbh-fhàs-bheairtean ann agus tha na pròtanan aca, thairis air milleanan de bhliadhnaichean de thaghadh nàdurrach, air fàs nas seasmhaiche ri teòthachd àrd. Thathas air a mholadh gun cleachdar DNA polymerases bho bacteria thermophilic. Thionndaidh na h-enzyman sin gu bhith thermostable agus bha iad comasach air seasamh an aghaidh mòran chuairtean freagairt. Le bhith gan cleachdadh bha e comasach PCR a dhèanamh nas sìmplidhe agus a dhèanamh fèin-ghluasadach. Chaidh aon de na ciad polymerases DNA thermostable a sgaradh bhon bacterium Thermus aquaticus, a tha a’ fuireach ann an fuarain teth Pàirc Nàiseanta Yellowstone, agus chaidh ainmeachadh mar Taq polymerase.
Gu luath thàinig PCR gu bhith na neach-obrach aig Pròiseact Genome Daonna. San fharsaingeachd, chan eil am pròiseas eadar-dhealaichte bhon fhear a chaidh a leasachadh le Mullis, tha e dìreach air a bhith fèin-ghluasadach. Cha robh sinn tuilleadh an urra ri sluagh de dh’ oileanaich ceumnaiche dall a bhith a’ dòrtadh boinneagan de lionn a-steach do phìoban deuchainn plastaig. Ann an deuchainn-lannan an latha an-diugh a’ dèanamh sgrùdadh ginteil moileciuil, thèid an obair seo a dhèanamh air innealan-giùlain robotach. Bidh innealan-fuadain PCR a tha an sàs ann am pròiseact sreathachaidh cho mòr ris an Genome Daonna ag obair gun stad le meudan mòra de polymerase teas-sheasmhach. Bha cuid de luchd-saidheans a bha ag obair air a’ Phròiseact Genome Daonna air an sàrachadh leis na dleasdanasan mì-reusanta àrd a chuir sealbhadair a’ phaitinn PCR, am fuamhaire cungaidh gnìomhachais Eòrpach Hoffmann-LaRoche, ri cosgais stuthan cleachdaidh.
B’ e “prionnsabal dràibhidh” eile an dòigh sreath DNA fhèin. Cha robh bunait ceimigeach an dòigh seo ùr tuilleadh aig an àm sin: ghabh am Pròiseact Genome Daonna Eadar-stàite (HGP) ris an aon dòigh innleachdach a bha Fred Sanger air a leasachadh ann am meadhan nan 1970n. Bha an innleachdas anns an sgèile agus an ìre fèin-ghluasaid a bha e comasach dha sreath a choileanadh.
Chaidh sreathadh fèin-ghluasadach a leasachadh an toiseach ann an obair-lann Lee Hood aig Institiùd Teicneòlais California. Chaidh e dhan àrd-sgoil ann am Montana agus chluich e ball-coise colaisde mar quarterback; Taing dha Hood, bhuannaich an sgioba farpais na stàite barrachd air aon uair. Thàinig na sgilean obair-sgioba aige gu feum cuideachd na chùrsa-beatha saidheansail. Bha sgioba de cheimigearan, bith-eòlaichean agus innleadairean ag obair ann an obair-lann Hood, agus cha b’ fhada gus an robh an obair-lann aige na stiùiriche ann an ùr-ghnàthachadh teicneòlach.
Gu dearbh, chaidh an dòigh sreathachaidh fèin-ghluasadach a chruthachadh le Lloyd Smith agus Mike Hunkapiller. Thàinig Mike Hunkapiller, a bha an uairsin ag obair ann an obair-lann Hood, gu Lloyd Smith le moladh airson dòigh sreathachaidh nas fheàrr anns am biodh dath eadar-dhealaichte air gach seòrsa bunait. Dh’ fhaodadh a leithid de bheachd ceithir uiread a dhèanamh air èifeachdas pròiseas Sanger. Ann an Sanger, nuair a bhios iad a 'cur an òrdugh anns gach aon de na ceithir tiùban (a rèir an àireamh de bhunaitean), le com-pàirt DNA polymerase, thèid seata sònraichte de oligonucleotides de dhiofar fhaid a chruthachadh, a' gabhail a-steach sreath primer. An uairsin, chaidh formamide a chur ris na tiùban airson sgaradh slabhraidh agus chaidh electrophoresis gel polyacrylamide a dhèanamh air ceithir slighean. Ann an dreach Smith agus Hunkapiller, tha dideoxynucleotides air an comharrachadh le ceithir dathan eadar-dhealaichte agus tha PCR air a dhèanamh ann an aon phìob. An uairsin, rè electrophoresis gel polyacrylamide, bidh beam laser aig àite sònraichte air an gel a ’togail gnìomhachd nan dathan, agus bidh an lorgaire a’ dearbhadh dè an nucleotide a tha an-dràsta a ’dèanamh imrich tron ghel. An toiseach, bha Mac a’ Ghobhainn eu-dòchasach - bha eagal air gun toireadh cleachdadh dòsan ultra-ìosal de dhath gun deidheadh na roinnean nucleotide eadar-dhealaichte. Ach, le deagh thuigse air teicneòlas laser, cha b’ fhada gus an lorg e slighe a-mach às an t-suidheachadh le bhith a’ cleachdadh dathan sònraichte fluorochrome a bhios flùraiseach nuair a bhios e fosgailte do rèididheachd laser.
(Dreach slàn - 4,08 MB) Clò-bhualadh grinn: sreath DNA air a chuir an òrdugh a’ cleachdadh seicheadair fèin-ghluasadach, air fhaighinn bho inneal seicheamhachaidh fèin-ghluasadach. Bidh gach dath a’ freagairt ri aon de cheithir bhunaitean
Anns an dreach clasaigeach den dòigh Sanger, tha aon de na dualan den DNA sgrùdaichte ag obair mar theamplaid airson synthesis dualan co-phàirteach leis an enzyme DNA polymerase, agus an uairsin tha an sreath de mhìrean DNA air a sheòrsachadh ann an gel a rèir meud. Tha gach criomag, a tha air a ghabhail a-steach san DNA rè synthesis agus a leigeas le toraidhean ath-bhualadh fhaicinn às deidh sin, air a chomharrachadh le dath flùraiseach a tha co-chosmhail ris a’ bhunait crìche (chaidh seo a dheasbad air td. 124); mar sin, bidh fluorescence a’ chriomag seo na aithnichear airson bonn sònraichte. An uairsin chan eil air fhàgail ach lorg a dhèanamh agus na toraidhean ath-bhualadh fhaicinn. Tha na toraidhean air an sgrùdadh le coimpiutair agus air an taisbeanadh mar shreath de stùcan ioma-dathte a rèir ceithir nucleotides. Tha am fiosrachadh an uairsin air a ghluasad gu dìreach gu siostam fiosrachaidh a’ choimpiutair, a’ cur às don phròiseas inntrigidh dàta a tha a’ caitheamh ùine agus uaireannan pianail a rinn an t-sreath gu math duilich.
» Gheibhear barrachd fiosrachaidh mun leabhar aig
»
»
Airson Khabrozhiteley lasachadh 25% a’ cleachdadh coupon - PCR
Source: www.habr.com