O premio Nobel estadounidense de química Kary Mullis morreu en California aos 74 anos. Segundo a súa muller, a morte ocorreu o 7 de agosto. A causa é a insuficiencia cardíaca e respiratoria por pneumonía.
O propio James Watson, o descubridor da molécula de ADN, falaranos da contribución que fixo á bioquímica e pola que recibiu o Premio Nobel.
Fragmento do libro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. Historia da revolución xenética
Capítulo 7. Xenoma humano. Escenario de vida
...
A reacción en cadea da polimerase (PCR) foi inventada en 1983 polo bioquímico Carey Mullis, que traballaba en Cetus. O descubrimento desta reacción foi bastante notable. Mullis recordou máis tarde: "Un venres á noite de abril de 1983, tiven unha epifanía. Estaba ao volante, conducindo por unha estrada de montaña sinuosa e iluminada pola luar no norte de California, a terra dos bosques de secuoias. É impresionante que fose en tal situación na que a inspiración o golpeou. E non é que o norte de California teña estradas especiais que promovan a percepción; é que o seu amigo viu unha vez a Mullis acelerar temerariamente por unha autovía xeada e non lle molestou nada. Un amigo díxolle ao New York Times: "Mullis tivo a visión de que morrería chocando contra unha secuoia. Polo tanto, non lle ten medo a nada mentres conduce, a non ser que haxa secuoias na estrada”. A presenza de secuoias ao longo da estrada obrigou a Mullis a concentrarse e... aquí estaba, unha visión. Mullis recibiu o Premio Nobel de Química polo seu invento en 1993 e desde entón volveuse aínda máis estraño nas súas accións. Por exemplo, é partidario da teoría revisionista de que a SIDA non está relacionada co VIH, o que minou significativamente a súa propia reputación e interferiu cos médicos.
A PCR é unha reacción bastante sinxela. Para levala a cabo, necesitamos dous cebadores sintetizados quimicamente que sexan complementarios dos extremos opostos das distintas cadeas do fragmento de ADN necesario. Os cebadores son seccións curtas de ADN monocatenario, cada unha duns 20 pares de bases de lonxitude. A peculiaridade dos cebadores é que se corresponden coas seccións de ADN que hai que amplificar, é dicir, a plantilla de ADN.
(Imaxe clicable) Kary Mullis, inventor da PCR
A especificidade da PCR baséase na formación de complexos complementarios entre o molde e os cebadores, oligonucleótidos sintéticos curtos. Cada un dos cebadores é complementario a unha das cadeas do molde de dobre cadea e limita o inicio e o final da rexión amplificada. De feito, a "matriz" resultante é todo un xenoma, e o noso obxectivo é illar del os fragmentos que nos interesan. Para iso, a plantilla de ADN de dobre cadea quéntase a 95 °C durante varios minutos para separar as febras de ADN. Esta etapa chámase desnaturalización porque os enlaces de hidróxeno entre as dúas cadeas de ADN están rotos. Unha vez que as febras se separaron, a temperatura redúcese para permitir que os cebadores se unan ao molde monocatenario. A ADN polimerase comeza a replicación do ADN uníndose a un tramo da cadea de nucleótidos. O encima ADN polimerase replica a cadea molde usando un cebador como cebador ou exemplo para a copia. Como resultado do primeiro ciclo, obtemos a duplicación secuencial múltiple dunha determinada sección de ADN. A continuación repetimos este procedemento. Despois de cada ciclo obtemos unha área obxectivo en dobre cantidade. Despois de vinte e cinco ciclos de PCR (é dicir, en menos de dúas horas), temos a rexión do ADN que nos interesa nunha cantidade 225 veces superior á orixinal (é dicir, amplificámola aproximadamente 34 millóns de veces). De feito, na entrada recibimos unha mestura de cebadores, ADN modelo, o encima ADN polimerase e bases libres A, C, G e T, a cantidade dun produto de reacción específico (limitado polos cebadores) crece exponencialmente e o número de copias de ADN "longas" é lineal, polo que na reacción dominan os produtos.
Amplificación da sección de ADN desexada: reacción en cadea da polimerase
Nos primeiros días da PCR, o principal problema era o seguinte: despois de cada ciclo de quecemento-arrefriamento, a ADN polimerase tivo que engadirse á mestura de reacción, xa que estaba inactivada a unha temperatura de 95 ° C. Por iso, foi necesario volver engadila antes de cada un dos 25 ciclos. O procedemento de reacción era relativamente ineficiente, requiría moito tempo e a enzima polimerase, e o material era moi caro. Por sorte, a Nai Natureza veu ao rescate. Moitos animais séntense cómodos a temperaturas moi superiores aos 37 °C. Por que a cifra de 37 °C se fixo importante para nós? Isto ocorreu porque esta temperatura é óptima para E. coli, da que se obtivo orixinalmente o encima polimerase para a PCR. Na natureza existen microorganismos cuxas proteínas, ao longo de millóns de anos de selección natural, fixéronse máis resistentes ás altas temperaturas. Propúxose utilizar ADN polimerases de bacterias termófilas. Estes encimas resultaron ser termoestables e foron capaces de soportar moitos ciclos de reacción. O seu uso permitiu simplificar e automatizar a PCR. Unha das primeiras ADN polimerases termoestables foi illada da bacteria Thermus aquaticus, que vive nas augas termais do Parque Nacional de Yellowstone, e chamouse Taq polimerase.
A PCR converteuse rapidamente no cabalo de batalla do Proxecto Xenoma Humano. En xeral, o proceso non é diferente do desenvolvido por Mullis, acaba de ser automatizado. Xa non dependíamos dunha multitude de estudantes de posgrao cegos que botaran esmerilosamente gotas de líquido en tubos de ensaio de plástico. Nos laboratorios modernos que realizan investigacións xenéticas moleculares, este traballo realízase en transportadores robóticos. Os robots de PCR implicados nun proxecto de secuenciación tan grande como o xenoma humano traballan sen descanso con enormes volumes de polimerase termoestable. Algúns científicos que traballan no Proxecto Xenoma Humano mostráronse indignados polas regalías excesivamente altas engadidas ao custo dos consumibles polo propietario da patente PCR, o xigante farmacéutico industrial europeo Hoffmann-LaRoche.
Outro "principio impulsor" foi o propio método de secuenciación do ADN. A base química deste método xa non era nova naquel momento: o Proxecto do xenoma humano interestatal (HGP) adoptou o mesmo método enxeñoso que Fred Sanger desenvolvera a mediados dos anos 1970. A innovación residía na escala e grao de automatización que a secuenciación foi capaz de acadar.
A secuenciación automatizada desenvolveuse orixinalmente no laboratorio de Lee Hood no Instituto Tecnolóxico de California. Asistiu ao instituto en Montana e xogou ao fútbol universitario como mariscal de campo; Grazas a Hood, o equipo gañou o campionato estatal máis dunha vez. As súas habilidades de traballo en equipo tamén foron útiles na súa carreira científica. O laboratorio de Hood contaba cun equipo variado de químicos, biólogos e enxeñeiros, e o seu laboratorio pronto converteuse nun líder en innovación tecnolóxica.
De feito, o método de secuenciación automatizada foi inventado por Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que entón traballaba no laboratorio de Hood, achegouse a Lloyd Smith cunha proposta dun método de secuenciación mellorado no que cada tipo de base sería coloreado de forma diferente. Tal idea podería cuadriplicar a eficiencia do proceso Sanger. En Sanger, ao secuenciar en cada un dos catro tubos (segundo o número de bases), coa participación da ADN polimerase, fórmase un conxunto único de oligonucleótidos de diferentes lonxitudes, incluíndo unha secuencia de cebadores. A continuación, engadiuse formamida aos tubos para a separación da cadea e realizouse a electroforese en xel de poliacrilamida en catro carrís. Na versión de Smith e Hunkapiller, os didesoxinucleótidos están marcados con catro colorantes diferentes e a PCR realízase nun tubo. Despois, durante a electroforese en xel de poliacrilamida, un raio láser nun lugar específico do xel excita a actividade dos colorantes e o detector determina que nucleótido está a migrar actualmente a través do xel. Ao principio, Smith era pesimista: temía que usar doses ultra baixas de colorante levase a que as rexións de nucleótidos fosen indistinguibles. Non obstante, tendo unha excelente comprensión da tecnoloxía láser, pronto atopou unha forma de saír da situación mediante o uso de colorantes fluorocromos especiais que emiten fluorescencia cando se expón á radiación láser.
(Versión completa - 4,08 MB) Letra pequena: secuencia de ADN secuenciada mediante un secuenciador automático, obtida a partir dunha máquina de secuenciación automática. Cada cor corresponde a unha das catro bases
Na versión clásica do método Sanger, unha das cadeas do ADN analizado actúa como molde para a síntese dunha cadea complementaria polo encima ADN polimerase, a continuación, a secuencia de fragmentos de ADN clasifícase nun xel por tamaño. Cada fragmento que se inclúe no ADN durante a síntese e que permite a visualización posterior dos produtos da reacción está marcado cun colorante fluorescente correspondente á base terminal (diso comentouse na páx. 124); polo tanto, a fluorescencia deste fragmento será un identificador para unha base determinada. Despois só queda realizar a detección e visualizar os produtos da reacción. Os resultados analízanse por ordenador e preséntanse como unha secuencia de picos multicolores correspondentes a catro nucleótidos. Despois, a información transfírese directamente ao sistema de información do ordenador, eliminando o proceso de entrada de datos que dificultaba moito a secuenciación.
» Podes atopar máis detalles sobre o libro en
»
»
Para Khabrozhiteley 25% de desconto usando o cupón - PCR
Fonte: www.habr.com