નોબેલ પુરસ્કાર વિજેતા કેરી મુલિસ, ડીએનએ પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શનના શોધકનું અવસાન થયું છે

રસાયણશાસ્ત્રમાં નોબેલ પુરસ્કાર વિજેતા અમેરિકન કેરી મુલિસનું કેલિફોર્નિયામાં 74 વર્ષની વયે અવસાન થયું. તેની પત્નીના કહેવા પ્રમાણે, મૃત્યુ 7 ઓગસ્ટના રોજ થયું હતું. કારણ ન્યુમોનિયાને કારણે હૃદય અને શ્વસન નિષ્ફળતા છે.

ડીએનએ પરમાણુના શોધક જેમ્સ વોટસન પોતે અમને બાયોકેમિસ્ટ્રીમાં તેમના યોગદાન વિશે જણાવશે અને જેના માટે તેમને નોબેલ પુરસ્કાર મળ્યો હતો.

જેમ્સ વોટસન, એન્ડ્રુ બેરી, કેવિન ડેવિસના પુસ્તકમાંથી અંશો

ડીએનએ. આનુવંશિક ક્રાંતિનો ઇતિહાસ

પ્રકરણ 7. માનવ જીનોમ. જીવન દૃશ્ય

...
પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (PCR) ની શોધ 1983 માં સેટસ ખાતે કામ કરતા બાયોકેમિસ્ટ કેરી મુલિસ દ્વારા કરવામાં આવી હતી. આ પ્રતિક્રિયાની શોધ તદ્દન નોંધપાત્ર હતી. મુલિસે પાછળથી યાદ કર્યું: “એપ્રિલ 1983માં એક શુક્રવારની સાંજે, મારી પાસે એપિફેની હતી. હું વ્હીલ પાછળ હતો, ઉત્તરી કેલિફોર્નિયામાં, રેડવૂડ જંગલોની ભૂમિમાં, ચંદ્રના પ્રકાશમાં, પર્વતીય માર્ગને વળાંક આપતો હતો." તે પ્રભાવશાળી છે કે તે એવી પરિસ્થિતિમાં હતો કે પ્રેરણા તેને ત્રાટકી. અને એવું નથી કે ઉત્તરી કેલિફોર્નિયામાં ખાસ રસ્તાઓ છે જે આંતરદૃષ્ટિને પ્રોત્સાહન આપે છે; તે માત્ર એટલું જ છે કે તેના મિત્રએ એકવાર મુલિસને બર્ફીલા ડ્યુઅલ કેરેજવે પર અવિચારી રીતે ગતિ કરતા જોયો હતો અને તે તેને જરાય પરેશાન કરતું ન હતું. એક મિત્રએ ન્યૂ યોર્ક ટાઈમ્સને કહ્યું: “મુલિસને એક સ્વપ્ન હતું કે તે રેડવુડના ઝાડ સાથે અથડાઈને મરી જશે. તેથી, તે ડ્રાઇવિંગ કરતી વખતે કોઈ પણ વસ્તુથી ડરતો નથી, સિવાય કે રસ્તાની બાજુમાં લાલ લાકડાના ઝાડ ઉગતા હોય." રસ્તા પર રેડવુડ્સની હાજરીએ મુલિસને ધ્યાન કેન્દ્રિત કરવા દબાણ કર્યું અને... અહીં તે એક સમજ હતી. મુલિસને 1993 માં તેમની શોધ માટે રસાયણશાસ્ત્રમાં નોબેલ પુરસ્કાર મળ્યો હતો અને ત્યારથી તેમની ક્રિયાઓ વધુ અજાણી બની ગઈ છે. ઉદાહરણ તરીકે, તે સુધારણાવાદી સિદ્ધાંતના સમર્થક છે કે એઇડ્સ એચઆઇવી સાથે સંબંધિત નથી, જેણે તેની પોતાની પ્રતિષ્ઠાને નોંધપાત્ર રીતે નુકસાન પહોંચાડ્યું હતું અને ડોકટરો સાથે દખલ કરી હતી.

પીસીઆર એકદમ સરળ પ્રતિક્રિયા છે. તેને હાથ ધરવા માટે, અમને બે રાસાયણિક રીતે સંશ્લેષિત પ્રાઈમર્સની જરૂર છે જે જરૂરી DNA ટુકડાના વિવિધ સેરના વિરુદ્ધ છેડાને પૂરક છે. પ્રાઇમર્સ સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએના ટૂંકા વિભાગો છે, દરેક લંબાઈમાં લગભગ 20 બેઝ પેર છે. પ્રાઇમર્સની ખાસિયત એ છે કે તેઓ ડીએનએ વિભાગોને અનુરૂપ છે જેને વિસ્તૃત કરવાની જરૂર છે, એટલે કે, ડીએનએ ટેમ્પલેટ.

(છબી ક્લિક કરી શકાય તેવી) કેરી મુલિસ, પીસીઆરના શોધક

પીસીઆરની વિશિષ્ટતા ટેમ્પલેટ અને પ્રાઇમર્સ, ટૂંકા કૃત્રિમ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ વચ્ચેના પૂરક સંકુલની રચના પર આધારિત છે. દરેક પ્રાઈમર ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ટેમ્પ્લેટની એક સેર માટે પૂરક છે અને એમ્પ્લીફાઈડ પ્રદેશની શરૂઆત અને અંતને મર્યાદિત કરે છે. વાસ્તવમાં, પરિણામી "મેટ્રિક્સ" એ સંપૂર્ણ જીનોમ છે, અને અમારો ધ્યેય તેમાંથી અમને રસના ટુકડાઓને અલગ કરવાનો છે. આ કરવા માટે, ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટેમ્પલેટને ડીએનએ સેરને અલગ કરવા માટે ઘણી મિનિટો માટે 95 ° સે પર ગરમ કરવામાં આવે છે. આ તબક્કાને વિકૃતિકરણ કહેવામાં આવે છે કારણ કે બે ડીએનએ સેર વચ્ચેના હાઇડ્રોજન બોન્ડ તૂટી ગયા છે. એકવાર સેર અલગ થઈ જાય પછી, પ્રાઈમર્સને સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ટેમ્પ્લેટ સાથે જોડવા માટે તાપમાન ઘટાડવામાં આવે છે. ડીએનએ પોલિમરેઝ ન્યુક્લિયોટાઇડ સાંકળના પટ સાથે બંધાઈને ડીએનએ પ્રતિકૃતિ શરૂ કરે છે. એન્ઝાઇમ ડીએનએ પોલિમરેઝ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરીને ટેમ્પલેટ સ્ટ્રાન્ડની નકલ કરે છે અથવા નકલ કરવા માટે ઉદાહરણ તરીકે. પ્રથમ ચક્રના પરિણામે, અમે ચોક્કસ DNA વિભાગના બહુવિધ અનુક્રમિક બમણું મેળવીએ છીએ. આગળ આપણે આ પ્રક્રિયાને પુનરાવર્તિત કરીએ છીએ. દરેક ચક્ર પછી આપણે બમણા જથ્થામાં લક્ષ્ય વિસ્તાર મેળવીએ છીએ. પચીસ પીસીઆર ચક્ર પછી (એટલે ​​કે, બે કલાકથી ઓછા સમયમાં), અમારી પાસે મૂળ કરતાં 225 ગણી વધારે રકમમાં અમને રસનો ડીએનએ પ્રદેશ છે (એટલે ​​કે, અમે તેને લગભગ 34 મિલિયન વખત વિસ્તૃત કર્યો છે). હકીકતમાં, ઇનપુટ પર અમને પ્રાઇમર્સ, ટેમ્પલેટ ડીએનએ, ડીએનએ પોલિમરેઝ એન્ઝાઇમ અને ફ્રી બેઝ A, C, G અને Tનું મિશ્રણ પ્રાપ્ત થયું, ચોક્કસ પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનની માત્રા (પ્રાઇમર દ્વારા મર્યાદિત) ઝડપથી વધે છે, અને સંખ્યા "લાંબી" ડીએનએ નકલો રેખીય છે, તેથી પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોમાં પ્રભુત્વ ધરાવે છે.

ઇચ્છિત ડીએનએ વિભાગનું એમ્પ્લીફિકેશન: પોલિમરેઝ સાંકળ પ્રતિક્રિયા

પીસીઆરના શરૂઆતના દિવસોમાં, મુખ્ય સમસ્યા નીચે મુજબ હતી: દરેક હીટિંગ-કૂલિંગ ચક્ર પછી, ડીએનએ પોલિમરેઝને પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં ઉમેરવું પડતું હતું, કારણ કે તે 95 ° સે તાપમાને નિષ્ક્રિય થઈ ગયું હતું. તેથી, દરેક 25 ચક્ર પહેલાં તેને ફરીથી ઉમેરવું જરૂરી હતું. પ્રતિક્રિયા પ્રક્રિયા પ્રમાણમાં બિનકાર્યક્ષમ હતી, ઘણો સમય અને પોલિમરેઝ એન્ઝાઇમની જરૂર હતી, અને સામગ્રી ખૂબ ખર્ચાળ હતી. સદભાગ્યે, માતા કુદરત બચાવમાં આવી. ઘણા પ્રાણીઓ 37 °C કરતા વધુ તાપમાનમાં આરામદાયક અનુભવે છે. શા માટે આંકડો 37 °C આપણા માટે મહત્વપૂર્ણ બન્યો? આવું થયું કારણ કે આ તાપમાન E. coli માટે શ્રેષ્ઠ છે, જેમાંથી PCR માટે પોલિમરેઝ એન્ઝાઇમ મૂળરૂપે મેળવવામાં આવ્યું હતું. પ્રકૃતિમાં એવા સુક્ષ્મસજીવો છે જેમના પ્રોટીન, કુદરતી પસંદગીના લાખો વર્ષોથી, ઊંચા તાપમાને વધુ પ્રતિરોધક બન્યા છે. થર્મોફિલિક બેક્ટેરિયામાંથી ડીએનએ પોલિમરેસનો ઉપયોગ કરવાની દરખાસ્ત કરવામાં આવી છે. આ ઉત્સેચકો થર્મોસ્ટેબલ હોવાનું બહાર આવ્યું અને ઘણા પ્રતિક્રિયા ચક્રનો સામનો કરવામાં સક્ષમ હતા. તેમના ઉપયોગથી પીસીઆરને સરળ અને સ્વચાલિત કરવાનું શક્ય બન્યું. પ્રથમ થર્મોસ્ટેબલ ડીએનએ પોલિમરેઝમાંથી એક બેક્ટેરિયમ થર્મસ એક્વેટીકસથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું, જે યલોસ્ટોન નેશનલ પાર્કના ગરમ ઝરણામાં રહે છે, અને તેને તાક પોલિમરેઝ નામ આપવામાં આવ્યું હતું.

પીસીઆર ઝડપથી હ્યુમન જીનોમ પ્રોજેક્ટનું વર્કહોર્સ બની ગયું. સામાન્ય રીતે, આ પ્રક્રિયા મુલિસ દ્વારા વિકસાવવામાં આવેલી પ્રક્રિયાથી અલગ નથી, તે માત્ર સ્વચાલિત કરવામાં આવી છે. અમે હવે મંદબુદ્ધિવાળા સ્નાતક વિદ્યાર્થીઓની ભીડ પર નિર્ભર ન હતા જેઓ પરિશ્રમપૂર્વક પ્લાસ્ટિકની ટેસ્ટ ટ્યુબમાં પ્રવાહીના ટીપાં રેડતા હતા. મોલેક્યુલર આનુવંશિક સંશોધન હાથ ધરતી આધુનિક પ્રયોગશાળાઓમાં, આ કાર્ય રોબોટિક કન્વેયર પર કરવામાં આવે છે. હ્યુમન જીનોમ જેટલા મોટા સિક્વન્સિંગ પ્રોજેક્ટમાં સામેલ પીસીઆર રોબોટ હીટ-સ્ટેબલ પોલિમરેઝના વિશાળ જથ્થા સાથે અવિરતપણે કામ કરે છે. હ્યુમન જીનોમ પ્રોજેક્ટ પર કામ કરતા કેટલાક વૈજ્ઞાનિકો પીસીઆર પેટન્ટ, યુરોપિયન ઔદ્યોગિક ફાર્માસ્યુટિકલ જાયન્ટ હોફમેન-લારોચેના માલિક દ્વારા ઉપભોજ્ય વસ્તુઓની કિંમતમાં વધારાની ગેરવાજબી રીતે ઊંચી રોયલ્ટીથી રોષે ભરાયા હતા.

અન્ય "ડ્રાઇવિંગ સિદ્ધાંત" એ ડીએનએ સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિ હતી. તે સમયે આ પદ્ધતિનો રાસાયણિક આધાર હવે નવો ન હતો: ઇન્ટરસ્ટેટ હ્યુમન જીનોમ પ્રોજેક્ટ (HGP) એ એ જ બુદ્ધિશાળી પદ્ધતિ અપનાવી હતી જે ફ્રેડ સેંગરે 1970 ના દાયકાના મધ્યમાં વિકસાવી હતી. નવીનતા ઓટોમેશનના સ્કેલ અને ડિગ્રીમાં છે જે સિક્વન્સિંગ પ્રાપ્ત કરવામાં સક્ષમ હતી.

કેલિફોર્નિયા ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ ટેક્નોલોજી ખાતે લી હૂડની પ્રયોગશાળામાં ઓટોમેટેડ સિક્વન્સિંગનો વિકાસ થયો હતો. તેણે મોન્ટાનામાં હાઈસ્કૂલમાં અભ્યાસ કર્યો અને ક્વાર્ટરબેક તરીકે કોલેજ ફૂટબોલ રમ્યો; હૂડનો આભાર, ટીમે એક કરતા વધુ વખત રાજ્ય ચેમ્પિયનશિપ જીતી. તેમની ટીમ વર્ક કુશળતા પણ તેમની વૈજ્ઞાનિક કારકિર્દીમાં કામ આવી. હૂડની પ્રયોગશાળામાં રસાયણશાસ્ત્રીઓ, જીવવિજ્ઞાનીઓ અને એન્જિનિયરોના એક મોટલી ક્રૂ દ્વારા સ્ટાફ હતો, અને તેની પ્રયોગશાળા ટૂંક સમયમાં તકનીકી નવીનતામાં અગ્રણી બની ગઈ.

વાસ્તવમાં, લોયડ સ્મિથ અને માઇક હંકપિલર દ્વારા સ્વચાલિત સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિની શોધ કરવામાં આવી હતી. માઈક હંકાપિલરે, જે પછી હૂડની પ્રયોગશાળામાં કામ કર્યું હતું, તેણે લોયડ સ્મિથને સુધારેલ ક્રમ પદ્ધતિની દરખાસ્ત સાથે સંપર્ક કર્યો જેમાં દરેક પ્રકારનો આધાર અલગ-અલગ રંગીન હશે. આવો વિચાર સેંગર પ્રક્રિયાની કાર્યક્ષમતામાં ચાર ગણો વધારો કરી શકે છે. સેંગરમાં, જ્યારે ડીએનએ પોલિમરેઝની સહભાગિતા સાથે, ચાર ટ્યુબમાંની દરેકમાં અનુક્રમણિકા કરવામાં આવે છે, ત્યારે પ્રાઈમર સિક્વન્સ સહિત વિવિધ લંબાઈના ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો એક અનન્ય સમૂહ રચાય છે. આગળ, સાંકળને અલગ કરવા માટે ટ્યુબમાં ફોર્મામાઇડ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને ચાર લેન પર પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ કરવામાં આવ્યું હતું. સ્મિથ અને હંકાપિલરના સંસ્કરણમાં, ડીડિયોક્સિન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ચાર અલગ અલગ રંગો સાથે લેબલ કરવામાં આવે છે અને પીસીઆર એક નળીમાં કરવામાં આવે છે. પછી, પોલિએક્રાયલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દરમિયાન, જેલ પર ચોક્કસ સ્થાન પર લેસર બીમ રંગોની પ્રવૃત્તિને ઉત્તેજિત કરે છે, અને ડિટેક્ટર નક્કી કરે છે કે જેલ દ્વારા હાલમાં કયું ન્યુક્લિયોટાઇડ સ્થળાંતર કરી રહ્યું છે. શરૂઆતમાં, સ્મિથ નિરાશાવાદી હતા - તેમને ડર હતો કે ડાયના અલ્ટ્રા-લો ડોઝનો ઉપયોગ ન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રદેશોને અસ્પષ્ટ બનાવવા તરફ દોરી જશે. જો કે, લેસર ટેક્નોલોજીની ઉત્તમ સમજ ધરાવતાં, તેમણે લેસર રેડિયેશનના સંપર્કમાં આવે ત્યારે ફ્લોરોસ થતા ખાસ ફ્લોરોક્રોમ રંગોનો ઉપયોગ કરીને ટૂંક સમયમાં પરિસ્થિતિમાંથી બહાર નીકળવાનો માર્ગ શોધી કાઢ્યો.

(સંપૂર્ણ સંસ્કરણ ક્લિક કરીને - 4,08 MB) ફાઈન પ્રિન્ટઃ ડીએનએ સિક્વન્સ ઑટોમેટિક સિક્વન્સરનો ઉપયોગ કરીને ક્રમબદ્ધ, ઑટોમેટિક સિક્વન્સિંગ મશીનમાંથી મેળવવામાં આવે છે. દરેક રંગ ચાર પાયામાંથી એકને અનુરૂપ છે

સેંગર પદ્ધતિના ક્લાસિક સંસ્કરણમાં, વિશ્લેષણ કરાયેલ ડીએનએની એક સેર એન્ઝાઇમ ડીએનએ પોલિમરેઝ દ્વારા પૂરક સ્ટ્રાન્ડના સંશ્લેષણ માટે નમૂના તરીકે કાર્ય કરે છે, પછી ડીએનએ ટુકડાઓનો ક્રમ કદ દ્વારા જેલમાં ગોઠવવામાં આવે છે. દરેક ટુકડો, જે સંશ્લેષણ દરમિયાન ડીએનએમાં સમાવિષ્ટ હોય છે અને પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોના અનુગામી વિઝ્યુલાઇઝેશનને મંજૂરી આપે છે, તેને ટર્મિનલ બેઝને અનુરૂપ ફ્લોરોસન્ટ ડાઇ સાથે લેબલ કરવામાં આવે છે (આની ચર્ચા પૃષ્ઠ 124 પર કરવામાં આવી હતી); તેથી, આ ટુકડાનું ફ્લોરોસેન્સ આપેલ આધાર માટે ઓળખકર્તા હશે. પછી જે બાકી રહે છે તે તપાસ કરવા અને પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોની કલ્પના કરવાનું છે. પરિણામોનું કોમ્પ્યુટર દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે અને ચાર ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને અનુરૂપ બહુ-રંગીન શિખરોના ક્રમ તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે. તે પછી માહિતી સીધી કમ્પ્યુટરની માહિતી સિસ્ટમમાં સ્થાનાંતરિત થાય છે, જે સમય માંગી લેતી અને કેટલીકવાર પીડાદાયક ડેટા એન્ટ્રી પ્રક્રિયાને દૂર કરે છે જેણે સિક્વન્સિંગને ખૂબ જ મુશ્કેલ બનાવ્યું હતું.

» પુસ્તક વિશે વધુ માહિતી માટે, કૃપા કરીને મુલાકાત લો પ્રકાશકની વેબસાઇટ
» સમાવિષ્ટોનું કોષ્ટક
» અવતરણ

Khabrozhiteli માટે કૂપન પર 25% ડિસ્કાઉન્ટ - પીસીઆર

સોર્સ: www.habr.com