डीएनए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के आविष्कारक नोबेल पुरस्कार विजेता कैरी मुलिस का निधन हो गया है

रसायन विज्ञान में अमेरिकी नोबेल पुरस्कार विजेता कैरी मुलिस का 74 वर्ष की आयु में कैलिफोर्निया में निधन हो गया। उनकी पत्नी के मुताबिक मौत 7 अगस्त को हुई. इसका कारण निमोनिया के कारण हृदय और श्वसन विफलता है।

डीएनए अणु के खोजकर्ता जेम्स वॉटसन खुद हमें जैव रसायन में उनके योगदान के बारे में बताएंगे और जिसके लिए उन्हें नोबेल पुरस्कार मिला।

जेम्स वॉटसन, एंड्रयू बेरी, केविन डेविस की पुस्तक का अंश

डीएनए. आनुवंशिक क्रांति का इतिहास

अध्याय 7. मानव जीनोम। जीवन परिदृश्य

...
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का आविष्कार 1983 में बायोकेमिस्ट कैरी मुलिस ने किया था, जो सेटस में काम करते थे। इस प्रतिक्रिया की खोज काफी उल्लेखनीय थी. मुलिस ने बाद में याद किया: “अप्रैल 1983 में एक शुक्रवार की शाम, मुझे एक दिव्य अनुभूति हुई। मैं पहिए के पीछे था, रेडवुड जंगलों की भूमि, उत्तरी कैलिफोर्निया में एक चांदनी, घुमावदार पहाड़ी सड़क पर गाड़ी चला रहा था। यह प्रभावशाली है कि ऐसी स्थिति में ही उन्हें प्रेरणा मिली। और ऐसा नहीं है कि उत्तरी कैलिफोर्निया में विशेष सड़कें हैं जो अंतर्दृष्टि को बढ़ावा देती हैं; यह सिर्फ इतना है कि उसके दोस्त ने एक बार मुलिस को बर्फीले दोहरे रास्ते पर लापरवाही से गाड़ी चलाते हुए देखा था और इससे उसे बिल्कुल भी परेशानी नहीं हुई। एक दोस्त ने न्यूयॉर्क टाइम्स को बताया: “मुलिस को सपना आया था कि वह एक रेडवुड पेड़ से टकराकर मर जाएगा। इसलिए, वह गाड़ी चलाते समय किसी भी चीज़ से नहीं डरता, जब तक कि सड़क के किनारे लाल लकड़ी के पेड़ न उगे हों। सड़क के किनारे लाल लकड़ियों की मौजूदगी ने मुलिस को ध्यान केंद्रित करने के लिए मजबूर किया और... यहाँ यह एक अंतर्दृष्टि थी। मुलिस को 1993 में अपने आविष्कार के लिए रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार मिला और तब से वह अपने कार्यों में और भी अजीब हो गए हैं। उदाहरण के लिए, वह संशोधनवादी सिद्धांत का समर्थक है कि एड्स एचआईवी से संबंधित नहीं है, जिसने उसकी अपनी प्रतिष्ठा को काफी हद तक कमजोर कर दिया और डॉक्टरों के साथ हस्तक्षेप किया।

पीसीआर एक काफी सरल प्रतिक्रिया है. इसे पूरा करने के लिए, हमें दो रासायनिक रूप से संश्लेषित प्राइमरों की आवश्यकता है जो आवश्यक डीएनए टुकड़े के विभिन्न स्ट्रैंड के विपरीत सिरों के पूरक हैं। प्राइमर एकल-फंसे डीएनए के छोटे खंड होते हैं, जिनमें से प्रत्येक की लंबाई लगभग 20 आधार जोड़े होती है। प्राइमरों की ख़ासियत यह है कि वे डीएनए अनुभागों के अनुरूप होते हैं जिन्हें प्रवर्धित करने की आवश्यकता होती है, यानी डीएनए टेम्पलेट।

(छवि क्लिक करने योग्य) कैरी मुलिस, पीसीआर के आविष्कारक

पीसीआर की विशिष्टता टेम्पलेट और प्राइमर, लघु सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बीच पूरक परिसरों के गठन पर आधारित है। प्रत्येक प्राइमर डबल-स्ट्रैंडेड टेम्पलेट के किसी एक स्ट्रैंड का पूरक है और प्रवर्धित क्षेत्र की शुरुआत और अंत को सीमित करता है। वास्तव में, परिणामी "मैट्रिक्स" एक संपूर्ण जीनोम है, और हमारा लक्ष्य इसमें से हमारी रुचि के अंशों को अलग करना है। ऐसा करने के लिए, डीएनए स्ट्रैंड को अलग करने के लिए डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्पलेट को कई मिनट तक 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है। इस चरण को विकृतीकरण कहा जाता है क्योंकि दो डीएनए स्ट्रैंड के बीच हाइड्रोजन बंधन टूट जाते हैं। एक बार जब स्ट्रैंड अलग हो जाते हैं, तो प्राइमर को सिंगल-स्ट्रैंडेड टेम्पलेट से जुड़ने की अनुमति देने के लिए तापमान कम कर दिया जाता है। डीएनए पोलीमरेज़ न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला के एक खंड से जुड़कर डीएनए प्रतिकृति शुरू करता है। एंजाइम डीएनए पोलीमरेज़ टेम्पलेट स्ट्रैंड को प्रतिलिपि बनाने के लिए प्राइमर या उदाहरण के रूप में उपयोग करके प्रतिलिपि बनाता है। पहले चक्र के परिणामस्वरूप, हमें एक निश्चित डीएनए अनुभाग का एकाधिक अनुक्रमिक दोहरीकरण प्राप्त होता है। आगे हम इस प्रक्रिया को दोहराते हैं। प्रत्येक चक्र के बाद हमें दोगुनी मात्रा में लक्ष्य क्षेत्र प्राप्त होता है। पच्चीस पीसीआर चक्रों के बाद (अर्थात, दो घंटे से भी कम समय में), हमारे लिए डीएनए क्षेत्र मूल से 225 गुना अधिक मात्रा में रुचिकर होता है (अर्थात, हमने इसे लगभग 34 मिलियन गुना बढ़ाया है)। वास्तव में, इनपुट पर हमें प्राइमर, टेम्पलेट डीएनए, डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम और मुक्त आधार ए, सी, जी और टी का मिश्रण प्राप्त हुआ, एक विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा (प्राइमर द्वारा सीमित) तेजी से बढ़ती है, और संख्या "लंबी" डीएनए प्रतियां रैखिक होती हैं, इसलिए प्रतिक्रिया में उत्पाद हावी होते हैं।

वांछित डीएनए अनुभाग का प्रवर्धन: पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया

पीसीआर के शुरुआती दिनों में, मुख्य समस्या निम्नलिखित थी: प्रत्येक ताप-शीतलन चक्र के बाद, डीएनए पोलीमरेज़ को प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ना पड़ता था, क्योंकि यह 95 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर निष्क्रिय हो जाता था। इसलिए, प्रत्येक 25 चक्र से पहले इसे दोबारा जोड़ना आवश्यक था। प्रतिक्रिया प्रक्रिया अपेक्षाकृत अप्रभावी थी, इसमें बहुत अधिक समय और पोलीमरेज़ एंजाइम की आवश्यकता थी, और सामग्री बहुत महंगी थी। सौभाग्य से, प्रकृति माँ बचाव में आई। कई जानवर 37 डिग्री सेल्सियस से कहीं अधिक तापमान पर सहज महसूस करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस का आंकड़ा हमारे लिए क्यों महत्वपूर्ण हो गया? ऐसा इसलिए हुआ क्योंकि यह तापमान ई. कोलाई के लिए इष्टतम है, जिससे पीसीआर के लिए पोलीमरेज़ एंजाइम मूल रूप से प्राप्त किया गया था। प्रकृति में ऐसे सूक्ष्मजीव हैं जिनके प्रोटीन, प्राकृतिक चयन के लाखों वर्षों में, उच्च तापमान के प्रति अधिक प्रतिरोधी हो गए हैं। थर्मोफिलिक बैक्टीरिया से डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करने का प्रस्ताव किया गया है। ये एंजाइम थर्मोस्टेबल निकले और कई प्रतिक्रिया चक्रों का सामना करने में सक्षम थे। उनके उपयोग से पीसीआर को सरल और स्वचालित करना संभव हो गया। पहले थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ में से एक को जीवाणु थर्मस एक्वाटिकस से अलग किया गया था, जो येलोस्टोन नेशनल पार्क के गर्म झरनों में रहता है, और इसका नाम टाक पोलीमरेज़ रखा गया था।

पीसीआर शीघ्र ही मानव जीनोम परियोजना का कार्यक्षेत्र बन गया। सामान्य तौर पर, यह प्रक्रिया मुलिस द्वारा विकसित प्रक्रिया से अलग नहीं है, इसे केवल स्वचालित किया गया है। हम अब मंदबुद्धि स्नातक छात्रों की भीड़ पर निर्भर नहीं थे जो परिश्रमपूर्वक प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब में तरल की बूंदें डालते थे। आणविक आनुवंशिक अनुसंधान करने वाली आधुनिक प्रयोगशालाओं में, यह कार्य रोबोटिक कन्वेयर पर किया जाता है। मानव जीनोम जितनी बड़ी अनुक्रमण परियोजना में शामिल पीसीआर रोबोट भारी मात्रा में ताप-स्थिर पोलीमरेज़ के साथ लगातार काम करते हैं। मानव जीनोम परियोजना पर काम करने वाले कुछ वैज्ञानिक पीसीआर पेटेंट के मालिक, यूरोपीय औद्योगिक फार्मास्युटिकल दिग्गज हॉफमैन-लारोचे द्वारा उपभोग्य सामग्रियों की लागत में जोड़े गए अनुचित रूप से उच्च रॉयल्टी से नाराज थे।

एक अन्य "ड्राइविंग सिद्धांत" डीएनए अनुक्रमण विधि ही थी। इस पद्धति का रासायनिक आधार उस समय नया नहीं था: अंतरराज्यीय मानव जीनोम परियोजना (एचजीपी) ने उसी सरल पद्धति को अपनाया जिसे फ्रेड सेंगर ने 1970 के दशक के मध्य में विकसित किया था। नवाचार स्वचालन के पैमाने और डिग्री में निहित था जिसे अनुक्रमण प्राप्त करने में सक्षम था।

स्वचालित अनुक्रमण मूल रूप से कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी में ली हूड की प्रयोगशाला में विकसित किया गया था। उन्होंने मोंटाना में हाई स्कूल में पढ़ाई की और क्वार्टरबैक के रूप में कॉलेज फुटबॉल खेला; हुड की बदौलत टीम ने एक से अधिक बार राज्य चैंपियनशिप जीती। उनका टीम वर्क कौशल उनके वैज्ञानिक करियर में भी काम आया। हुड की प्रयोगशाला में रसायनज्ञों, जीवविज्ञानियों और इंजीनियरों के एक विविध दल का स्टाफ था और उनकी प्रयोगशाला जल्द ही तकनीकी नवाचार में अग्रणी बन गई।

वास्तव में, स्वचालित अनुक्रमण विधि का आविष्कार लॉयड स्मिथ और माइक हंकापिलर ने किया था। माइक हंकापिलर, जो उस समय हुड की प्रयोगशाला में काम कर रहे थे, एक बेहतर अनुक्रमण विधि के प्रस्ताव के साथ लॉयड स्मिथ के पास पहुंचे, जिसमें प्रत्येक प्रकार के आधार को अलग-अलग रंग दिया जाएगा। ऐसा विचार सेंगर प्रक्रिया की दक्षता को चौगुना कर सकता है। सेंगर में, डीएनए पोलीमरेज़ की भागीदारी के साथ, चार ट्यूबों (आधारों की संख्या के अनुसार) में से प्रत्येक में अनुक्रमण करते समय, प्राइमर अनुक्रम सहित विभिन्न लंबाई के ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का एक अनूठा सेट बनता है। इसके बाद, चेन पृथक्करण के लिए ट्यूबों में फॉर्मामाइड जोड़ा गया और चार लेन पर पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस किया गया। स्मिथ और हंकपिल्लर के संस्करण में, डिडॉक्सीन्यूक्लियोटाइड्स को चार अलग-अलग रंगों के साथ लेबल किया जाता है और पीसीआर एक ट्यूब में किया जाता है। फिर, पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान, जेल पर एक विशिष्ट स्थान पर एक लेजर बीम रंगों की गतिविधि को उत्तेजित करता है, और डिटेक्टर यह निर्धारित करता है कि कौन सा न्यूक्लियोटाइड वर्तमान में जेल के माध्यम से स्थानांतरित हो रहा है। सबसे पहले, स्मिथ निराशावादी थे - उन्हें डर था कि डाई की अति-निम्न खुराक का उपयोग करने से न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र अप्रभेद्य हो जाएंगे। हालाँकि, लेज़र तकनीक की उत्कृष्ट समझ होने के कारण, उन्होंने जल्द ही विशेष फ़्लोरोक्रोम रंगों का उपयोग करके स्थिति से बाहर निकलने का रास्ता खोज लिया, जो लेज़र विकिरण के संपर्क में आने पर प्रतिदीप्त हो जाते हैं।

(पूर्ण संस्करण क्लिक पर - 4,08 एमबी) फाइन प्रिंट: एक स्वचालित अनुक्रमण मशीन से प्राप्त डीएनए अनुक्रम को एक स्वचालित अनुक्रमक का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाता है। प्रत्येक रंग चार आधारों में से एक से मेल खाता है

सेंगर विधि के क्लासिक संस्करण में, विश्लेषण किए गए डीएनए के स्ट्रैंड में से एक एंजाइम डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा पूरक स्ट्रैंड के संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है, फिर डीएनए टुकड़ों के अनुक्रम को आकार के अनुसार एक जेल में क्रमबद्ध किया जाता है। प्रत्येक टुकड़ा जो संश्लेषण के दौरान डीएनए में शामिल होता है और बाद में प्रतिक्रिया उत्पादों के दृश्य की अनुमति देता है, उसे टर्मिनल बेस के अनुरूप फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया जाता है (इस पर पी. 124 पर चर्चा की गई थी); इसलिए, इस टुकड़े की प्रतिदीप्ति किसी दिए गए आधार के लिए एक पहचानकर्ता होगी। फिर जो कुछ बचा है वह प्रतिक्रिया उत्पादों का पता लगाना और कल्पना करना है। परिणामों का विश्लेषण कंप्यूटर द्वारा किया जाता है और चार न्यूक्लियोटाइड के अनुरूप बहु-रंगीन चोटियों के अनुक्रम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। फिर जानकारी को सीधे कंप्यूटर की सूचना प्रणाली में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिससे समय लेने वाली और कभी-कभी दर्दनाक डेटा प्रविष्टि प्रक्रिया समाप्त हो जाती है जिससे अनुक्रमण करना बहुत कठिन हो जाता है।

»पुस्तक के बारे में अधिक विवरण यहां पाया जा सकता है प्रकाशक की वेबसाइट
» लेख-सूची
» अंश

खाब्रोझिटेले के लिए कूपन का उपयोग करके 25% की छूट - पीसीआर

स्रोत: www.habr.com