Američki dobitnik Nobelove nagrade za kemiju Kary Mullis preminuo je u Kaliforniji u 74. godini života. Prema riječima njegove supruge, smrt je nastupila 7. kolovoza. Uzrok je zatajenje srca i disanja zbog upale pluća.
Sam James Watson, pronalazač molekule DNK, ispričat će nam kakav je doprinos biokemiji i za koji je dobio Nobelovu nagradu.
Ulomak iz knjige Jamesa Watsona, Andrewa Berryja, Kevina Davisa
DNK. Povijest genetske revolucije
Poglavlje 7. Ljudski genom. Životni scenarij
...
Lančanu reakciju polimerazom (PCR) izumio je 1983. biokemičar Carey Mullis, koji je radio u Cetusu. Otkriće ove reakcije bilo je prilično izvanredno. Mullis se kasnije prisjećao: “Jednog petka navečer u travnju 1983. doživio sam prosvetljenje. Bio sam za volanom, vozeći se vijugavom planinskom cestom obasjanom mjesečinom u sjevernoj Kaliforniji, zemlji šuma sekvoja.” Impresivno je da ga je upravo u takvoj situaciji sinula inspiracija. I nije da sjeverna Kalifornija ima posebne ceste koje promiču uvid; samo što je njegov prijatelj jednom vidio Mullisa kako neoprezno juri po zaleđenom dvokolniku i to mu nije nimalo smetalo. Prijatelj je za New York Times rekao: “Mullis je imao viziju da će umrijeti zabivši se u sekvoju. Stoga se ničega ne boji u vožnji, osim ako uz cestu ne rastu sekvoje.” Prisutnost sekvoja uz cestu natjerala je Mullisa da se koncentrira i... evo ga, uvid. Mullis je za svoj izum 1993. dobio Nobelovu nagradu za kemiju i od tada je postao još čudniji u svojim postupcima. Primjerice, zagovornik je revizionističke teorije da AIDS nije povezan s HIV-om, što mu je značajno narušilo ugled i zasmetalo liječnicima.
PCR je prilično jednostavna reakcija. Da bismo to izveli, potrebna su nam dva kemijski sintetizirana početnica koja su komplementarna suprotnim krajevima različitih niti potrebnog fragmenta DNA. Primeri su kratki odsječci jednolančane DNA, svaki dug oko 20 parova baza. Posebnost početnica je u tome što odgovaraju dijelovima DNA koje je potrebno umnožiti, odnosno DNA šabloni.
(Slika se može kliknuti) Kary Mullis, izumitelj PCR-a
Specifičnost PCR-a temelji se na stvaranju komplementarnih kompleksa između kalupa i početnica, kratkih sintetskih oligonukleotida. Svaki od početnica je komplementaran s jednom od niti dvolančane matrice i ograničava početak i kraj amplificirane regije. Zapravo, rezultirajuća "matrica" je cijeli genom, a naš cilj je iz njega izolirati fragmente koji nas zanimaju. Da bi se to postiglo, predložak dvolančane DNK zagrijava se na 95 °C nekoliko minuta kako bi se odvojile niti DNK. Ova faza se naziva denaturacija jer se vodikove veze između dva lanca DNK prekidaju. Nakon što se niti razdvoje, temperatura se snižava kako bi se primeri mogli vezati na jednolančani predložak. DNA polimeraza započinje replikaciju DNA vezanjem na dio nukleotidnog lanca. Enzim DNA polimeraza replicira lanac predloška koristeći početnicu kao početnicu ili primjer za kopiranje. Kao rezultat prvog ciklusa dobivamo višestruko sekvencijalno udvostručenje određenog dijela DNK. Zatim ponavljamo ovaj postupak. Nakon svakog ciklusa dobivamo ciljano područje u dvostrukoj količini. Nakon dvadeset i pet PCR ciklusa (dakle, u manje od dva sata), imamo regiju DNK koja nas zanima u količini 225 puta većoj od originalne (odnosno, amplificirali smo je približno 34 milijuna puta). Naime, na ulazu smo dobili mješavinu primera, šablonske DNA, enzima DNA polimeraze i slobodnih baza A, C, G i T, količina specifičnog produkta reakcije (ograničena početnicama) eksponencijalno raste, a broj “dugih” kopija DNA je linearan, pa u produktima reakcije dominira.
Amplifikacija željenog dijela DNA: lančana reakcija polimerazom
U ranim danima PCR-a, glavni problem je bio sljedeći: nakon svakog ciklusa grijanja-hlađenja, DNA polimeraza je morala biti dodana u reakcijsku smjesu, jer je bila inaktivirana na temperaturi od 95 °C. Stoga ga je bilo potrebno ponovno dodati prije svakog od 25 ciklusa. Postupak reakcije bio je relativno neučinkovit, zahtijevao je puno vremena i enzima polimeraze, a materijal je bio vrlo skup. Srećom, majka priroda je priskočila u pomoć. Mnoge se životinje osjećaju ugodno na temperaturama višim od 37 °C. Zašto nam je brojka od 37 °C postala važna? To se dogodilo jer je ova temperatura optimalna za E. coli, iz koje je izvorno dobiven enzim polimeraza za PCR. U prirodi postoje mikroorganizmi čiji su proteini, tijekom milijuna godina prirodne selekcije, postali otporniji na visoke temperature. Predloženo je korištenje DNA polimeraza iz termofilnih bakterija. Pokazalo se da su ti enzimi termostabilni i sposobni su izdržati mnoge reakcijske cikluse. Njihova uporaba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterije Thermus aquaticus, koja živi u toplim izvorima Nacionalnog parka Yellowstone, a nazvana je Taq polimeraza.
PCR je brzo postao radni konj Projekta ljudskog genoma. Općenito, proces se ne razlikuje od onoga koji je razvio Mullis, samo je automatiziran. Nismo više ovisili o gomili slijepih diplomiranih studenata koji su mukotrpno ulijevali kapljice tekućine u plastične epruvete. U suvremenim laboratorijima koji provode molekularna genetička istraživanja, taj se posao obavlja na robotskim transporterima. PCR roboti uključeni u projekt sekvenciranja velik poput ljudskog genoma neumoljivo rade s ogromnim količinama toplinski stabilne polimeraze. Neki znanstvenici koji rade na Projektu ljudskog genoma bili su ogorčeni nerazumno visokim tantijemama koje je vlasnik patenta za PCR, europski industrijski farmaceutski div Hoffmann-LaRoche, dodao na troškove potrošnog materijala.
Drugi "pokretački princip" bila je sama metoda sekvenciranja DNK. Kemijska osnova ove metode u to vrijeme više nije bila nova: Međudržavni projekt ljudskog genoma (HGP) usvojio je istu genijalnu metodu koju je razvio Fred Sanger još sredinom 1970-ih. Inovacija je bila u opsegu i stupnju automatizacije koju je sekvenciranje uspjelo postići.
Automatizirano sekvenciranje izvorno je razvijeno u laboratoriju Lee Hooda na Kalifornijskom institutu za tehnologiju. Pohađao je srednju školu u Montani i igrao sveučilišni nogomet kao bek; Zahvaljujući Hoodu, tim je više puta osvojio državno prvenstvo. Njegove vještine timskog rada također su mu dobro došle u znanstvenoj karijeri. U Hoodovom laboratoriju radila je šarolika ekipa kemičara, biologa i inženjera, a njegov je laboratorij ubrzo postao predvodnik u tehnološkim inovacijama.
Zapravo, automatiziranu metodu sekvenciranja izmislili su Lloyd Smith i Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, koji je tada radio u Hoodovom laboratoriju, obratio se Lloydu Smithu s prijedlogom za poboljšanu metodu sekvenciranja u kojoj bi svaka vrsta baze bila različito obojena. Takva ideja mogla bi učetverostručiti učinkovitost Sangerovog procesa. Kod Sangera, prilikom sekvenciranja u svakoj od četiri epruvete (prema broju baza), uz sudjelovanje DNA polimeraze, formira se jedinstveni skup oligonukleotida različitih duljina, uključujući sekvencu početnica. Zatim je u epruvete dodan formamid za odvajanje lanaca i elektroforeza u poliakrilamidnom gelu je izvedena na četiri trake. U Smithovoj i Hunkapillerovoj verziji, dideoksinukleotidi su obilježeni s četiri različite boje, a PCR se izvodi u jednoj epruveti. Zatim, tijekom elektroforeze u poliakrilamidnom gelu, laserska zraka na određenom mjestu na gelu pobuđuje aktivnost bojila, a detektor određuje koji nukleotid trenutno migrira kroz gel. Isprva je Smith bio pesimističan - bojao se da bi korištenje ultraniskih doza boje dovelo do toga da se nukleotidna područja ne mogu razlikovati. No, budući da je izvrsno poznavao lasersku tehnologiju, ubrzo je pronašao izlaz iz situacije koristeći posebne fluorokromne boje koje fluoresciraju kada su izložene laserskom zračenju.
(Puna verzija - 4,08 MB) Fini ispis: sekvenca DNK sekvencirana pomoću automatskog sekvencera, dobivena iz stroja za automatsko sekvenciranje. Svaka boja odgovara jednoj od četiri baze
U klasičnoj verziji Sangerove metode, jedan od lanaca analizirane DNA djeluje kao predložak za sintezu komplementarnog lanca pomoću enzima DNA polimeraze, zatim se slijed fragmenata DNA razvrstava u gelu po veličini. Svaki fragment koji je uključen u DNA tijekom sinteze i omogućuje kasniju vizualizaciju produkata reakcije označen je fluorescentnom bojom koja odgovara terminalnoj bazi (o tome je bilo riječi na str. 124); stoga će fluorescencija ovog fragmenta biti identifikator za danu bazu. Tada preostaje samo provesti detekciju i vizualizirati produkte reakcije. Rezultati se analiziraju računalom i prikazuju kao slijed raznobojnih vrhova koji odgovaraju četirima nukleotidima. Informacije se potom prenose izravno u informacijski sustav računala, čime se eliminira dugotrajan i ponekad bolan proces unosa podataka koji je jako otežavao sekvenciranje.
» Više detalja o knjizi možete pronaći na
»
»
Za Khabrozhiteley 25% popusta korištenjem kupona - PCR
Izvor: www.habr.com