Kaliforniában, 74 éves korában meghalt Kerry Mullis, az Egyesült Államok kémiai Nobel-díjasa. Felesége szerint a halál augusztus 7-én következett be. Az ok szívelégtelenség és légzési elégtelenség volt, tüdőgyulladás miatt.
Az általa a biokémiába tett hozzájárulásairól és a Nobel-díjat érő munkájáról James Watson, a DNS-molekula felfedezője beszél.
Részlet James Watson, Andrew Berry és Kevin Davis könyvéből
DNS. A genetikai forradalom története
7. fejezet. Az emberi genom. Az élet forgatókönyve
…
A polimeráz láncreakciót (PCR) 1983-ban Kerry Mullis biokémikus találta fel, aki a Cetus cégnél dolgozott. Ennek a reakciónak a felfedezése igencsak figyelemre méltó volt. Később Mullis így emlékezett: „Egyszer egy áprilisi péntek estén úgy éreztem, mintha megvilágosodtam volna. Éppen vezettem, és egy holdfényben fürdő kanyargós hegyi úton haladtam Észak-Kaliforniában, a szekviczerdők határában.” Imponáló, hogy egy ilyen helyzetben érte el az ihlet. Nem arról van szó, hogy Észak-Kaliforniának különleges útjai lennének, amelyek elősegítik az ihletet; egyszerűen csak a barátja látta, ahogy Mullis meggondolatlanul száguldozott egy jeges, kétirányú úton, ami őt egyáltalán nem zavarta. A barátja ezt mondta a New York Timesnak: „Mullis azt álmodta, hogy halálos balesetet szenved, miközben egy szekvenciába ütközik. Ezért nem fél vezetni, ha az út mentén nincsenek szekvenciák.” A szekvenciák jelenléte az úton Mullist összpontosítani késztette, és… íme, megvilágosodás. Felfedezéséért 1993-ban Nobel-díjat kapott kémiából, és azóta még különösebbé vált a viselkedésében. Például a revizionizmus elméletének támogatója, miszerint a HIV nem kapcsolódik az AIDS-hez, amellyel jelentősen aláásta saját hírnevét és zavarta az orvosokat.
A PCR egy meglehetősen egyszerű reakció. Az elvégzéséhez két kémiailag szintetizált primerre van szükség, amelyek megfelelnek a kívánt DNS-fragmentum különböző láncainak ellenkező végének. A primerek rövid, egyláncú DNS-szakaszok, mindegyik körülbelül 20 bázispár hosszú. A primerek jellemzője, hogy megfelelnek azoknak a DNS-szakaszoknak, amelyeket amplifikálni kell, azaz a DNS-mátrixnak.
(A kép kattintható) Kary Mullis, a PCR feltalálója
A PCR specificitása a komplementer komplexek kialakulásán alapul a mátrix és a primerek, rövid szintetikus oligonukleotidok között. Mindegyik primer komplementer az egyik láncnak a kétláncú mátrixban és korlátozza az amplifikált szakasz kezdetét és végét. A ténylegesen kapott "mátrix" egy egész genómot képvisel, és a célunk az, hogy kiemeljük belőle az érdekes fragmentumokat. Ehhez a kétláncú DNS-mátrixot 95 °C-ra melegítjük néhány percre, hogy a DNS láncai elváljanak. Ezt a szakaszt denaturációnak hívják, mivel a hidrogénkötések megszakadnak a két DNS lánc között. Amikor a láncok elváltak, a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy a primerek kapcsolódhassanak az egyláncú mátrixhoz. A DNS-polimeráz megkezdi a DNS replikációját, kötődve a nukleotidok láncának egy darabjához. A DNS-polimeráz enzim replikálja a mátrixláncot, a primert mint kiindulási alapot használva a másoláshoz. Az első ciklus eredményeként egy adott DNS szakasz többszörös, sorozatos megkettőzését kapjuk. Ezt a folyamatot ezután megismételjük. Minden egyes ciklus után a célszakasz dupláját kapjuk. Huszonöt PCR ciklus után (vagyis kevesebb mint két óra alatt) az érdeklődésünkre számot tartó DNS szakasz mennyisége 225-szörösére nő az eredetihez képest (tehát körülbelül 34 milliószoros amplifikációt végeztünk). Valójában bemeneti anyagunk egy keverék volt primerekből, mátrix DNS-ből, DNS-polimeráz enzimből és szabad A, C, G és T bázisokból, a reakció speciális termékének mennyisége (a primerekkel korlátozottan) exponenciálisan nő, míg a "hosszú" DNS másolatok mennyisége lineárisan, így a reakció termékeiben dominál.
A kívánt DNS szakasz amplifikációja: polimeráz láncreakció
A PCR használatának hajnalán a legfőbb probléma az volt, hogy minden egyes hevítési-hűtési ciklus után újra kellett adni a reakciókeverékhez DNS-polimerázt, mivel ez inaktiválódott 95 °C-on. Ezért szükséges volt újra hozzáadni minden egyes 25 ciklus előtt. A reakció végrehajtása viszonylag hatékonytalan volt, sok időt és polimeráz enzimet igényelt, amely nem olcsó anyag. Szerencsére a természet segített. Sok állat jól érzi magát 37 °C-nál jóval magasabb hőmérsékleten. De miért vált számunkra fontos 37 °C? Ez azért történt, mert ez a hőmérséklet optimális az E. coli számára, amelyből kezdetben a PCR-hez szükséges polimerázt nyerték. A természetben léteznek olyan mikroorganizmusok, amelyek fehérjéi a természetes kiválasztódás során, milliók alatt, hatékonyabbá váltak a magas hőmérsékletek hatásával szemben. Javasolták, hogy használjunk DNS-polimerázokat termosztabil baktériumokból. Ezek az enzimek hőstabilak voltak, és képesek voltak elviselni a reakciók számos ciklusát. Használatuk lehetővé tette a PCR eljárásának egyszerűsítését és automatizálását. Az egyik első termosztabil DNS-polimeráz a Thermus aquaticus baktériumból származik, amely a Yellowstone Nemzeti Park forró forrásaiban él, és Taq-polimeráznak nevezték el.
A PCR gyorsan a 'Humángenom' projekt fő munkahorsává vált. A folyamat lényegében nem különbözik a Mullis által kifejlesztett módszertől, csak automatizálták. Már nem fügtünk a nyüzsgő, gyakorlatlan posztgraduális hallgatóktól, akik fáradtan öntötték a cseppeket műanyag kémcsövekbe. A modern laboratóriumokban, amelyek molekuláris genetikai kutatásokat végeznek, ezt a munkát robotizált szalaghálózatok végzik. A PCR-robotok, amelyek egy ilyen nagyszabású szekvenálási projekt részei, mint a 'Humángenom', folyamatosan dolgoznak a hatalmas mennyiségű hőálló polimerázon. Néhány tudós, aki a 'Humángenom' projekten dolgozott, felháborodott az indokolatlanul magas költségeken, amelyeket a PCR szabadalmának tulajdonosa, a Hoffmann-LaRoche európai ipari-farmakémiai óriás rak hozzá az anyagköltségekhez.
A másik „mozgásban lévő erő” a DNS-szekvenálás módszere lett. E módszer kémiai alapja már nem volt újdonság: a Nemzetközi Humán Genom Projekt (HGP) megörökölte ugyanazt a ravasz módszert, amelyet Fred Sanger fejlesztett ki az 1970-es évek közepén. Az innováció a szekvenálás során elért méretben és automatizálás mértékében rejlett.
Az automatikus szekvenálást eredetileg Lee Hood laboratóriumában fejlesztették ki a Kaliforniai Műszaki Egyetemen. Hood a montanai iskolát fejezte be, és amerikai focizóként játszott csatárként; részben neki köszönhetően csapata többször is megnyerte az állami bajnokságot. A csapatmunkára való készségei a tudományos karrierjében is hasznosnak bizonyultak. Hood labora sokszínű vegyészek, biológusok és mérnökök csoportjának adott otthont, és rövid időn belül a technológiai innovációk élvonalába került.
Tényleg az automatikus szekvenálás módszerét Lloyd Smith és Mike Hunkapiller találta fel. Mike Hunkapiller, aki akkoriban a Hood laboratóriumban dolgozott, megkereste Lloyd Smith-t, javasolva egy fejlettebb szekvenálási módszert, amelyben a különböző típusú bázisokat mindegyiket más-más színre festették. Ez az ötlet négyszeresére növelheti a Sanger-féle módszer hatékonyságát. Sanger szekvenálásakor minden négy kémcsőben (a bázisok számával megegyezően) DNS-polimeráz jelenlétében egyedi oligonukleotid szettek keletkeznek, különböző hosszúságokkal, amelyek primer szekvenciát tartalmaznak. Ezt követően a kémcsövekhez formamid került az szálak elválasztására, és elektрофорézt végeztek poliakrilamid gélen négy sávban. A Smith és Hunkapiller változatban a dideszoxiribonukleotidokat négy különböző színezékkel jelölik, és PCR-t végeznek egy kémcsőben. Ezután az elektрофорézis során a lézerfény a gél egy adott pontján aktiválja a festékek aktivitását, és a detektor meghatározza, hogy melyik nukleotid migrál éppen a gélen. Eleinte Smith pesszimista volt — attól tartott, hogy a rendkívül kis mennyiségű festék használata miatt a nukleotid szegmensek észlelhetetlenné válnak. Azonban, mivel rendkívül jól ismerte a lézertechnológiákat, hamarosan megoldást talált a problémára, speciális fluoreszcens festékek alkalmazásával, amelyek fluoreszkálnak a lézersugarak hatására.
(Teljes verzió — 4,08 MB) Kisebb betűvel: a DNS szekvenciája, amelyet automatikus szekvenáló segítségével dekódoltak, az automatikus szekvenáló gépből származik. Minden szín egy négy bázis egyikét jelöli.
A klasszikus Sanger-módszer változatában a vizsgált DNS egyik láncának mátrixként kell szolgálnia a komplementer lánc szintéziséhez a DNS-polimeráz enzim által, majd a DNS-fragmentumok sorrendjét nagyság szerint rendezik gélben. Minden fragmentum, amely beépül a DNS-be a szintézis során, és lehetővé teszi a reakciós termékek későbbi vizualizálását, fluoreszcens festékkel van jelölve, amely a terminális bázisnak felel meg (erről a 124. oldalon volt szó); ezért ennek a fragmentumnak a fluoreszcenciája az adott bázis azonosítója lesz. Ezután csak a reakciós termékek detektálását és vizualizálását kell elvégezni. Az eredményeket számítógép segítségével elemzik, és négy nukleotidnak megfelelő, különböző színű csúcsok sorozataként mutatják be. Ezt követően az információt közvetlenül a számítógép információs rendszerébe továbbítják, ami kizárja az időigényes és néha fájdalmas adatbevitel folyamatát, ami jelentősen megnehezítette a szekvenálást.
» Részletesebben a könyvről a
»
»
A Habr lakói számára 25% kedvezmény a kuponnal — PCR
Forrás: habr.com
