Az amerikai kémiai Nobel-díjas Kary Mullis Kaliforniában hunyt el 74 éves korában. Felesége szerint a halál augusztus 7-én következett be. Ennek oka a tüdőgyulladás okozta szív- és légzési elégtelenség.
James Watson, a DNS-molekula felfedezője mesél majd nekünk a biokémiához való hozzájárulásáról, és amiért Nobel-díjat kapott.
Részlet James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis könyvéből
DNS. A genetikai forradalom története
7. fejezet Humán genom. Élet forgatókönyv
...
A polimeráz láncreakciót (PCR) Carey Mullis biokémikus találta fel 1983-ban, aki a Cetusnál dolgozott. Ennek a reakciónak a felfedezése egészen figyelemre méltó volt. Mullis később így emlékezett vissza: „1983 áprilisának egyik péntek estéjén epifániám volt. A volán mögött hajtottam egy holdfényes, kanyargós hegyi úton Észak-Kaliforniában, a vörösfenyős erdők földjén. Lenyűgöző, hogy egy ilyen helyzetben hatott rá az ihlet. És nem arról van szó, hogy Észak-Kaliforniában különleges utak vannak, amelyek elősegítik a belátást; csak arról van szó, hogy a barátja egyszer látta Mullist, amint meggondolatlanul száguldott egy jeges kettős útpályán, és ez egyáltalán nem zavarta. Egy barátja ezt mondta a New York Timesnak: „Mullisnak volt egy látomása, hogy meghal, ha nekiütközik egy vörösfenyőnek. Ezért nem fél semmitől vezetés közben, kivéve, ha vörösfenyő fák nőnek az út mentén.” A vörösfenyők jelenléte az út mentén arra kényszerítette Mullist, hogy koncentráljon, és... íme, egy betekintés. Mullis 1993-ban kapott kémiai Nobel-díjat találmányáért, és azóta még furcsábbá vált tetteiben. Például támogatja azt a revizionista elméletet, amely szerint az AIDS nem kapcsolódik a HIV-hez, ami jelentősen aláásta saját hírnevét, és zavarta az orvosokat.
A PCR meglehetősen egyszerű reakció. Ennek végrehajtásához két kémiailag szintetizált primerre van szükségünk, amelyek komplementerek a kívánt DNS-fragmens különböző szálainak ellentétes végeivel. A primerek egyszálú DNS rövid szakaszai, mindegyik körülbelül 20 bázispár hosszúságú. A primerek sajátossága, hogy megfelelnek az amplifikálandó DNS-szakaszoknak, vagyis a DNS-templátnak.
(A kép kattintható) Kary Mullis, a PCR feltalálója
A PCR specificitása a templát és a primerek, rövid szintetikus oligonukleotidok közötti komplementer komplexek képződésén alapul. Mindegyik primer komplementer a kétszálú templát egyik szálával, és korlátozza az amplifikált régió kezdetét és végét. Valójában az így létrejövő „mátrix” egy teljes genom, és az a célunk, hogy elkülönítsük tőle a számunkra érdekes töredékeket. Ehhez a kettős szálú DNS-templátot néhány percig 95 °C-ra melegítjük, hogy a DNS-szálakat elválasszuk. Ezt a szakaszt denaturációnak nevezik, mivel a két DNS-szál közötti hidrogénkötések megszakadnak. Miután a szálak szétválnak, a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy a primerek az egyszálú sablonhoz kötődjenek. A DNS-polimeráz elindítja a DNS-replikációt a nukleotidlánc egy szakaszához való kötődéssel. A DNS-polimeráz enzim replikálja a templátszálat, primert használva primerként vagy másolási példaként. Az első ciklus eredményeként egy bizonyos DNS-szakasz többszörös szekvenciális megkettőzését kapjuk. Ezután megismételjük ezt az eljárást. Minden ciklus után dupla mennyiségben kapunk célterületet. Huszonöt PCR ciklus után (azaz kevesebb, mint két óra alatt) a számunkra érdekes DNS-régió mennyisége 225-ször nagyobb, mint az eredeti (azaz megközelítőleg 34 milliószor amplifikáltuk). Valójában a bemeneten primerek, templát DNS, DNS polimeráz enzim és szabad A, C, G és T bázisok keverékét kaptuk, a specifikus reakciótermék mennyisége (amelyet a primerek korlátoznak) exponenciálisan nő, és a mennyiség A „hosszú” DNS-másolat lineáris, így a reakcióban a termékek dominálnak.
A kívánt DNS szakasz amplifikációja: polimeráz láncreakció
A PCR kezdeti napjaiban a fő probléma a következő volt: minden fűtési-hűtési ciklus után DNS-polimerázt kellett hozzáadni a reakcióelegyhez, mivel az 95 °C-on inaktiválódott. Ezért a 25 ciklus mindegyike előtt újra kellett hozzáadni. A reakcióeljárás viszonylag nem volt hatékony, sok időt és polimeráz enzimet igényelt, az anyag pedig nagyon drága volt. Szerencsére az anyatermészet megmentett. Sok állat jól érzi magát 37 °C-nál jóval magasabb hőmérsékleten. Miért vált számunkra fontossá a 37 °C? Ez azért történt, mert ez a hőmérséklet optimális az E. coli számára, amelyből eredetileg a PCR-hez szükséges polimeráz enzimet nyerték. A természetben vannak olyan mikroorganizmusok, amelyek fehérjéi több millió éves természetes szelekció során ellenállóbbá váltak a magas hőmérsékletekkel szemben. Termofil baktériumokból származó DNS-polimerázok alkalmazását javasolták. Ezek az enzimek hőstabilnak bizonyultak, és számos reakcióciklust képesek ellenállni. Használatuk lehetővé tette a PCR egyszerűsítését és automatizálását. Az egyik első hőstabil DNS-polimerázt a Thermus aquaticus baktériumból izolálták, amely a Yellowstone Nemzeti Park melegforrásaiban él, és a Taq polimeráz nevet kapta.
A PCR gyorsan a Human Genome Project igáslójává vált. Általánosságban elmondható, hogy a folyamat nem különbözik a Mullis által kifejlesztetttől, csak most automatizálták. Nem függtünk többé a vak végzős hallgatók tömegétől, akik fáradságosan folyadékcseppeket öntenek műanyag kémcsövekbe. A modern molekuláris genetikai kutatásokat végző laboratóriumokban ezt a munkát robotos szállítószalagokon végzik. Az emberi genomhoz hasonló méretű szekvenálási projektben részt vevő PCR-robotok könyörtelenül dolgoznak hatalmas mennyiségű hőstabil polimerázzal. A Human Genome Projecten dolgozó tudósok egy része felháborodott azon, hogy a PCR szabadalom tulajdonosa, a Hoffmann-LaRoche európai ipari gyógyszeripari óriáscég indokolatlanul magas jogdíjakat emelt a fogyóeszközök költségeihez.
Egy másik „vezető elv” maga a DNS-szekvenálási módszer volt. Ennek a módszernek a kémiai alapja akkoriban már nem volt új: az Interstate Human Genome Project (HGP) ugyanazt a zseniális módszert alkalmazta, amelyet Fred Sanger még az 1970-es évek közepén kifejlesztett. Az innováció az automatizálás mértékében és fokában rejlett, amelyet a szekvenálás el tudott érni.
Az automatizált szekvenálást eredetileg a California Institute of Technology Lee Hood laboratóriumában fejlesztették ki. Montanában járt középiskolába, és az egyetemen futballozott hátvédként; Hoodnak köszönhetően a csapat többször megnyerte az állami bajnokságot. Csapatmunkakészsége is jól jött tudományos pályáján. Hood laboratóriumában vegyészekből, biológusokból és mérnökökből álló tarka legénység dolgozott, és laboratóriuma hamarosan a technológiai innováció vezetőjévé vált.
Valójában az automatizált szekvenálási módszert Lloyd Smith és Mike Hunkapiller találta fel. Mike Hunkapiller, aki akkor a Hood laboratóriumában dolgozott, megkereste Lloyd Smith-t egy olyan továbbfejlesztett szekvenálási módszerre vonatkozó javaslattal, amelyben az egyes alaptípusokat másképp színeznék. Egy ilyen ötlet megnégyszerezheti a Sanger-eljárás hatékonyságát. A Sangerben a négy cső mindegyikében (a bázisok számától függően) végzett szekvenálás során a DNS-polimeráz részvételével egyedi, különböző hosszúságú oligonukleotid-készlet jön létre, beleértve a primerszekvenciát is. Ezután formamidot adtunk a csövekhez a lánc elválasztására, és poliakrilamid gélelektroforézist végeztünk négy sávon. Smith és Hunkapiller változatában a didezoxinukleotidokat négy különböző festékkel jelölik, és a PCR-t egy csőben végezzük. Ezután a poliakrilamid gélelektroforézis során a gélen egy meghatározott helyen lézersugár gerjeszti a festékek aktivitását, és a detektor meghatározza, hogy éppen melyik nukleotid vándorol át a gélen. Smith először pesszimista volt – attól tartott, hogy ultraalacsony dózisú festék használata a nukleotid régiók megkülönböztethetetlenné válásához vezetne. A lézertechnológiát kitűnően értve azonban hamar megtalálta a kiutat a helyzetből speciális fluorokróm festékek használatával, amelyek lézersugárzás hatására fluoreszkálnak.
(Teljes verzió - 4,08 MB) Finom betűs: Automatikus szekvenáló berendezéssel szekvenált DNS-szekvencia, amelyet egy automata szekvenáló gépből nyernek. Mindegyik szín a négy alap egyikének felel meg
A Sanger-módszer klasszikus változatában az elemzett DNS egyik szála templátként működik a komplementer szál szintéziséhez a DNS-polimeráz enzim által, majd a DNS-fragmensek szekvenciáját egy gélben méret szerint szétválogatják. Minden fragmens, amely a szintézis során bekerül a DNS-be, és lehetővé teszi a reakciótermékek későbbi megjelenítését, a terminális bázisnak megfelelő fluoreszcens festékkel van megjelölve (erről a 124. oldalon volt szó); ezért ennek a fragmentumnak a fluoreszcenciája egy adott bázis azonosítója lesz. Ezután már csak a reakciótermékek detektálása és vizualizálása van hátra. Az eredményeket számítógéppel elemezzük, és négy nukleotidnak megfelelő többszínű csúcsok sorozataként mutatjuk be. Az információk ezután közvetlenül a számítógép információs rendszerébe kerülnek, kiküszöbölve az időigényes és néha fájdalmas adatbeviteli folyamatot, amely nagyon megnehezítette a sorrendet.
» A könyvvel kapcsolatos további információkért látogasson el ide
»
»
Khabrozhiteli esetében 25% kedvezmény a kuponból - PCR
Forrás: will.com