Մահացել է Նոբելյան դափնեկիր, ԴՆԹ պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի գյուտարար Քերի Մալիսը

Կալիֆորնիայում 74 տարեկան հասակում մահացել է քիմիայի գծով ամերիկացի Նոբելյան մրցանակակիր Քերի Մալիսը։ Նրա կնոջ խոսքով՝ մահը տեղի է ունեցել օգոստոսի 7-ին։ Պատճառը թոքաբորբի պատճառով սրտի և շնչառական անբավարարությունն է:

Ինքը՝ Ջեյմս Ուոթսոնը՝ ԴՆԹ մոլեկուլի հայտնաբերողը, մեզ կպատմի կենսաքիմիայի մեջ իր ներդրած ավանդի մասին, և որի համար ստացել է Նոբելյան մրցանակ։

Հատված Ջեյմս Ուոթսոնի, Էնդրյու Բերիի, Քևին Դևիսի գրքից

ԴՆԹ. Գենետիկ հեղափոխության պատմություն

Գլուխ 7. Մարդու գենոմը. Կյանքի սցենար

...
Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) հայտնագործվել է 1983 թվականին կենսաքիմիկոս Քերի Մալիսի կողմից, ով աշխատում էր Cetus-ում։ Այս ռեակցիայի բացահայտումը բավականին ուշագրավ էր։ Ավելի ուշ Մալիսը հիշեց. «1983թ. ապրիլի մի ուրբաթ երեկո ես Աստվածահայտնություն ունեցա: Ես ղեկին էի, մեքենայով վարում էի լուսնյակ, ոլորապտույտ լեռնային ճանապարհով Հյուսիսային Կալիֆորնիայում՝ կարմրածայտի անտառների երկիրը»։ Տպավորիչ է, որ հենց նման իրավիճակում է ոգեշնչվել նրան։ Եվ այնպես չէ, որ հյուսիսային Կալիֆոռնիան ունի հատուկ ճանապարհներ, որոնք խթանում են խորաթափանցությունը. պարզապես նրա ընկերը մի անգամ տեսել է Մալիսին անխոհեմ արագությամբ ընթացող սառցե երկակի երթևեկելի մասով, և դա նրան ընդհանրապես չի անհանգստացրել: Ընկերներից մեկը պատմել է New York Times-ին. «Մալիսը տեսիլք ուներ, որ կմահանա՝ բախվելով կարմրածառի հետ: Ուստի նա ոչ մի բանից չի վախենում մեքենա վարելիս, եթե ճանապարհի երկայնքով կարմիր փայտի ծառեր չեն աճում»։ Ճանապարհի երկայնքով կարմրածայտերի առկայությունը ստիպեց Մալիսին կենտրոնանալ և... ահա, դա մի խորաթափանցություն էր: Մալիսն իր գյուտի համար Նոբելյան մրցանակ է ստացել քիմիայի բնագավառում 1993 թվականին և այդ ժամանակվանից ավելի տարօրինակ է դարձել իր գործողություններում: Օրինակ, նա ռեվիզիոնիստական ​​տեսության կողմնակիցն է, որ ՁԻԱՀ-ը կապված չէ ՄԻԱՎ-ի հետ, ինչը զգալիորեն խարխլեց իր հեղինակությունը և խանգարեց բժիշկներին:

PCR-ը բավականին պարզ ռեակցիա է: Այն իրականացնելու համար մեզ անհրաժեշտ է երկու քիմիական սինթեզված այբբենարան, որոնք լրացնում են անհրաժեշտ ԴՆԹ-ի բեկորների տարբեր շղթաների հակառակ ծայրերը: Պրայմերները միաշղթա ԴՆԹ-ի կարճ հատվածներ են՝ յուրաքանչյուրը մոտ 20 բազային զույգ երկարությամբ։ Պրայմերների առանձնահատկությունն այն է, որ դրանք համապատասխանում են ԴՆԹ-ի այն հատվածներին, որոնք պետք է ուժեղացվեն, այսինքն՝ ԴՆԹ-ի կաղապարը։

(Պատկերը սեղմելի) Կարի Մուլիս, PCR-ի գյուտարար

PCR-ի առանձնահատկությունը հիմնված է կաղապարի և պրայմերների, կարճ սինթետիկ օլիգոնուկլեոտիդների միջև կոմպլեմենտար համալիրների ձևավորման վրա: Յուրաքանչյուր այբբենարան լրացնում է երկշղթա կաղապարի շղթաներից մեկին և սահմանափակում է ուժեղացված շրջանի սկիզբն ու վերջը: Փաստորեն, ստացված «մատրիցան» մի ամբողջ գենոմ է, և մեր նպատակն է նրանից առանձնացնել մեզ հետաքրքրող բեկորները։ Դա անելու համար ԴՆԹ-ի երկշղթա կաղապարը մի քանի րոպե տաքացնում են մինչև 95 °C՝ ԴՆԹ-ի շղթաները բաժանելու համար։ Այս փուլը կոչվում է դենատուրացիա, քանի որ ԴՆԹ-ի երկու շղթաների միջև ջրածնային կապերը կոտրված են: Երբ թելերը բաժանվում են, ջերմաստիճանը իջեցվում է, որպեսզի այբբենարանները միանան միաշղթա կաղապարին: ԴՆԹ պոլիմերազը սկսում է ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը՝ միանալով նուկլեոտիդային շղթայի մի հատվածին: ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը կրկնօրինակում է կաղապարի շարանը՝ օգտագործելով այբբենարան՝ որպես այբբենարան կամ պատճենահանման օրինակ: Առաջին ցիկլի արդյունքում մենք ստանում ենք ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի բազմակի հաջորդական կրկնապատկում: Հաջորդը մենք կրկնում ենք այս ընթացակարգը. Յուրաքանչյուր ցիկլից հետո մենք ստանում ենք թիրախային տարածք կրկնակի քանակությամբ: Քսանհինգ PCR ցիկլերից հետո (այսինքն՝ երկու ժամից պակաս ժամանակում), մենք ունենք մեզ հետաքրքրող ԴՆԹ-ի տարածքը 225 անգամ ավելի մեծ քանակությամբ, քան սկզբնականը (այսինքն, մենք այն ուժեղացրել ենք մոտավորապես 34 միլիոն անգամ): Փաստորեն, մուտքագրման ժամանակ մենք ստացանք պրայմերների, կաղապարային ԴՆԹ-ի, ԴՆԹ պոլիմերազային ֆերմենտի և A, C, G և T ազատ հիմքերի խառնուրդ, կոնկրետ ռեակցիայի արտադրանքի քանակը (սահմանափակված պրայմերներով) երկրաչափականորեն աճում է, և թիվը. ԴՆԹ-ի «երկար» պատճենները գծային են, ուստի ռեակցիայի մեջ գերակշռում են արտադրանքները:

ԴՆԹ-ի ցանկալի հատվածի ուժեղացում՝ պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա

PCR-ի վաղ օրերին հիմնական խնդիրը հետևյալն էր. յուրաքանչյուր տաքացում-սառեցման ցիկլից հետո ԴՆԹ պոլիմերազը պետք է ավելացվեր ռեակցիայի խառնուրդին, քանի որ այն ապաակտիվացված էր 95 ° C ջերմաստիճանում: Հետևաբար, անհրաժեշտ էր այն կրկին ավելացնել 25 ցիկլերից առաջ։ Ռեակցիայի պրոցեդուրան համեմատաբար անարդյունավետ էր, պահանջվում էր շատ ժամանակ և պոլիմերազային ֆերմենտ, իսկ նյութը շատ թանկ էր։ Բարեբախտաբար, մայր բնությունը օգնության հասավ: Շատ կենդանիներ իրենց հարմարավետ են զգում 37 °C-ից շատ բարձր ջերմաստիճանում: Ինչո՞ւ մեզ համար կարևոր դարձավ 37 °C ցուցանիշը: Դա տեղի է ունեցել այն պատճառով, որ այս ջերմաստիճանը օպտիմալ է E. coli-ի համար, որից ի սկզբանե ստացվել է PCR-ի պոլիմերազային ֆերմենտը: Բնության մեջ կան միկրոօրգանիզմներ, որոնց սպիտակուցները, բնական ընտրության միլիոնավոր տարիների ընթացքում, ավելի դիմացկուն են դարձել բարձր ջերմաստիճանի նկատմամբ: Առաջարկվել է օգտագործել ջերմասեր բակտերիաներից ԴՆԹ պոլիմերազներ։ Պարզվեց, որ այս ֆերմենտները ջերմակայուն են և կարողացել են դիմակայել բազմաթիվ ռեակցիաների ցիկլերի։ Դրանց օգտագործումը հնարավորություն տվեց պարզեցնել և ավտոմատացնել PCR-ը: ԴՆԹ-ի առաջին ջերմակայուն պոլիմերազներից մեկը մեկուսացվել է Thermus aquaticus բակտերիայից, որն ապրում է Յելոուսթոուն ազգային պարկի տաք աղբյուրներում, և ստացել է Taq պոլիմերազ անվանումը։

PCR-ն արագորեն դարձավ Մարդու գենոմի նախագծի գործատուն: Ընդհանուր առմամբ, գործընթացը ոչնչով չի տարբերվում Mullis-ի մշակածից, այն պարզապես ավտոմատացվել է։ Մենք այլևս կախված չէինք խամրած ասպիրանտների ամբոխից, որոնք ջանասիրաբար հեղուկի կաթիլներ էին լցնում պլաստիկ փորձանոթների մեջ: Մոլեկուլային գենետիկական հետազոտություններ իրականացնող ժամանակակից լաբորատորիաներում այս աշխատանքը կատարվում է ռոբոտային փոխակրիչների վրա։ PCR ռոբոտները, որոնք ներգրավված են մարդկային գենոմի նման հաջորդականության նախագծում, անխնա աշխատում են ջերմակայուն պոլիմերազի հսկայական ծավալներով: Մարդկային գենոմի նախագծի վրա աշխատող որոշ գիտնականներ վրդովված էին PCR արտոնագրի սեփականատիրոջ՝ եվրոպական արդյունաբերական դեղագործական հսկայի Հոֆման-Լարոշի կողմից սպառվող նյութերի արժեքին ավելացված անհիմն բարձր հոնորարներից:

Մեկ այլ «շարժիչ սկզբունք» ԴՆԹ-ի հաջորդականության մեթոդն էր: Այս մեթոդի քիմիական հիմքն այն ժամանակ այլևս նոր չէր. Մարդու գենոմի միջպետական ​​նախագիծը (HGP) ընդունեց նույն հնարամիտ մեթոդը, որը Ֆրեդ Սանգերը մշակել էր դեռևս 1970-ականների կեսերին: Նորարարությունը կայանում էր ավտոմատացման մասշտաբով և աստիճանով, որին հաջողվեց հասնել հաջորդականության:

Ավտոմատացված հաջորդականությունը սկզբնապես մշակվել է Լի Հուդի լաբորատորիայում Կալիֆորնիայի տեխնոլոգիական ինստիտուտում: Նա սովորել է Մոնտանայի միջնակարգ դպրոցում և քոլեջի ֆուտբոլ է խաղացել որպես պաշտպան. Հուդի շնորհիվ թիմը մեկ անգամ չէ, որ հաղթել է նահանգի առաջնությունում։ Նրա թիմային աշխատանքի հմտությունները նույնպես օգտակար են եղել նրա գիտական ​​կարիերայում: Հուդի լաբորատորիան համալրված էր քիմիկոսների, կենսաբանների և ինժեներների խայտաբղետ անձնակազմով, և նրա լաբորատորիան շուտով դարձավ տեխնոլոգիական նորարարության առաջատարը:

Փաստորեն, ավտոմատացված հաջորդականության մեթոդը հայտնագործվել է Լլոյդ Սմիթի և Մայք Հունկապիլերի կողմից։ Մայք Հունկապիլլերը, որն այն ժամանակ աշխատում էր Հուդի լաբորատորիայում, մոտեցավ Լլոյդ Սմիթին՝ առաջարկելով կատարելագործված հաջորդականության մեթոդ, որի դեպքում հիմքերի յուրաքանչյուր տեսակ տարբեր գույներ կունենար: Նման գաղափարը կարող է քառապատկել Սանգերի գործընթացի արդյունավետությունը։ Սանգերում, չորս խողովակներից յուրաքանչյուրում (ըստ հիմքերի քանակի) հաջորդականության ժամանակ, ԴՆԹ պոլիմերազի մասնակցությամբ, ձևավորվում է տարբեր երկարությունների օլիգոնուկլեոտիդների եզակի հավաքածու՝ ներառյալ այբբենարանի հաջորդականությունը։ Այնուհետև խողովակներին ավելացվել է ֆորմամիդ՝ շղթայական տարանջատման համար, և պոլիակրիլամիդ գելային էլեկտրոֆորեզը կատարվել է չորս գծերի վրա: Սմիթի և Հունկապիլերի տարբերակում դիդեօքսինուկլեոտիդները պիտակավորված են չորս տարբեր ներկանյութերով, իսկ PCR-ն իրականացվում է մեկ խողովակում: Այնուհետև, պոլիակրիլամիդային գելի էլեկտրոֆորեզի ժամանակ, լազերային ճառագայթը գելի վրա որոշակի վայրում գրգռում է ներկերի ակտիվությունը, և դետեկտորը որոշում է, թե որ նուկլեոտիդն է ներկայումս ներգաղթում գելի միջով: Սկզբում Սմիթը հոռետես էր. նա մտավախություն ուներ, որ ներկանյութի չափազանց ցածր չափաբաժինների օգտագործումը կհանգեցնի նրան, որ նուկլեոտիդային շրջանները չեն տարբերվում: Այնուամենայնիվ, լավ հասկանալով լազերային տեխնոլոգիան, նա շուտով ելք գտավ ստեղծված իրավիճակից՝ օգտագործելով հատուկ ֆտորոքրոմ ներկանյութեր, որոնք լուսարձակվում են լազերային ճառագայթման ենթարկվելիս։

(Ամբողջական տարբերակը սեղմելով - 4,08 ՄԲ) Նուրբ տպագրություն. ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, որը կատարվում է ավտոմատ հաջորդականության միջոցով, ստացված ավտոմատ հաջորդականացման մեքենայից: Յուրաքանչյուր գույն համապատասխանում է չորս հիմքերից մեկին

Սանգերի մեթոդի դասական տարբերակում վերլուծված ԴՆԹ-ի շղթաներից մեկը գործում է որպես ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի կողմից լրացուցիչ շղթայի սինթեզի ձևանմուշ, այնուհետև ԴՆԹ-ի բեկորների հաջորդականությունը տեսակավորվում է գելի մեջ ըստ չափի: Յուրաքանչյուր բեկոր, որը ներառված է ԴՆԹ-ում սինթեզի ընթացքում և թույլ է տալիս ռեակցիայի արտադրանքի հետագա վիզուալացումը, պիտակավորված է տերմինալային հիմքին համապատասխան լյումինեսցենտային ներկով (սա քննարկվել է էջ 124-ում); հետևաբար, այս հատվածի ֆլյուորեսցենտը կլինի տվյալ բազայի նույնացուցիչը: Այնուհետև մնում է միայն հայտնաբերել և պատկերացնել ռեակցիայի արտադրանքը: Արդյունքները վերլուծվում են համակարգչով և ներկայացված են չորս նուկլեոտիդներին համապատասխանող բազմագույն գագաթների հաջորդականությամբ: Այնուհետև տեղեկատվությունը փոխանցվում է անմիջապես համակարգչի տեղեկատվական համակարգ՝ վերացնելով տվյալների մուտքագրման ժամանակատար և երբեմն ցավոտ գործընթացը, որը շատ դժվարացնում էր հաջորդականությունը:

» Գրքի մասին ավելի մանրամասն կարող եք գտնել այստեղ հրատարակչի կայքը
» Պահեստավորված նյութեր
» Հատված

Khabrozhiteley-ի համար 25% զեղչ՝ օգտագործելով կտրոնը - ՊՇՌ

Source: www.habr.com