Peraih Nobel Amerika di bidang kimia Kary Mullis meninggal di California pada usia 74 tahun. Menurut istrinya, kematian terjadi pada 7 Agustus. Penyebabnya adalah gagal jantung dan pernapasan akibat pneumonia.
James Watson sendiri, penemu molekul DNA, akan memberi tahu kita tentang kontribusinya terhadap biokimia dan mengapa ia menerima Hadiah Nobel.
Kutipan dari buku karya James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Sejarah Revolusi Genetik
Bab 7. Genom manusia. Skenario kehidupan
...
Reaksi berantai polimerase (PCR) ditemukan pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Carey Mullis, yang bekerja di Cetus. Penemuan reaksi ini sungguh luar biasa. Mullis kemudian mengenang: βSuatu Jumat malam di bulan April 1983, saya mendapat pencerahan. Saya berada di belakang kemudi, berkendara menyusuri jalan pegunungan yang diterangi cahaya bulan dan berkelok-kelok di California Utara, kawasan hutan redwood.β Sungguh mengesankan bahwa dalam situasi seperti itulah inspirasi datang padanya. Dan bukan karena California utara memiliki jalan khusus yang meningkatkan wawasan; hanya saja temannya pernah melihat Mullis melaju sembarangan di sepanjang jalur ganda yang tertutup es dan hal itu tidak mengganggunya sama sekali. Seorang teman mengatakan kepada New York Times: βMullis mendapat penglihatan bahwa dia akan mati karena menabrak pohon redwood. Oleh karena itu, dia tidak takut apa pun saat mengemudi, kecuali ada pohon sequoia yang tumbuh di sepanjang jalan.β Kehadiran pohon sequoia di sepanjang jalan memaksa Mullis berkonsentrasi dan... ini dia, sebuah wawasan. Mullis menerima Hadiah Nobel Kimia atas penemuannya pada tahun 1993 dan sejak itu tindakannya menjadi semakin aneh. Misalnya, dia adalah pendukung teori revisionis bahwa AIDS tidak ada hubungannya dengan HIV, yang secara signifikan merusak reputasinya dan mengganggu dokter.
PCR adalah reaksi yang cukup sederhana. Untuk melaksanakannya, kita memerlukan dua primer yang disintesis secara kimia yang saling melengkapi dengan ujung yang berlawanan dari untaian berbeda dari fragmen DNA yang diperlukan. Primer adalah bagian pendek dari DNA beruntai tunggal, masing-masing panjangnya sekitar 20 pasangan basa. Keunikan primer adalah bahwa mereka sesuai dengan bagian DNA yang perlu diamplifikasi, yaitu cetakan DNA.
(Gambar dapat diklik) Kary Mullis, penemu PCR
Spesifisitas PCR didasarkan pada pembentukan kompleks komplementer antara templat dan primer, oligonukleotida sintetik pendek. Setiap primer melengkapi salah satu helai templat beruntai ganda dan membatasi awal dan akhir daerah yang diamplifikasi. Faktanya, βmatriksβ yang dihasilkan adalah keseluruhan genom, dan tujuan kami adalah mengisolasi bagian-bagian yang kami minati darinya. Untuk melakukan ini, cetakan DNA untai ganda dipanaskan hingga 95 Β°C selama beberapa menit untuk memisahkan untai DNA. Tahap ini disebut denaturasi karena ikatan hidrogen antara kedua untai DNA terputus. Setelah untaian terpisah, suhu diturunkan agar primer dapat berikatan dengan templat untai tunggal. DNA polimerase memulai replikasi DNA dengan mengikat rangkaian rantai nukleotida. Enzim DNA polimerase mereplikasi untai cetakan menggunakan primer sebagai primer atau contoh untuk penyalinan. Sebagai hasil dari siklus pertama, kita memperoleh beberapa penggandaan berurutan dari bagian DNA tertentu. Selanjutnya kita ulangi prosedur ini. Setelah setiap siklus kami memperoleh area target dalam jumlah ganda. Setelah dua puluh lima siklus PCR (yaitu, dalam waktu kurang dari dua jam), kami memiliki wilayah DNA yang kami minati dalam jumlah 225 kali lebih tinggi dari aslinya (yaitu, kami telah memperkuatnya sekitar 34 juta kali). Faktanya, pada masukan kami menerima campuran primer, DNA cetakan, enzim DNA polimerase dan basa bebas A, C, G dan T, jumlah produk reaksi spesifik (dibatasi oleh primer) tumbuh secara eksponensial, dan jumlahnya salinan DNA βpanjangβ bersifat linier, sehingga produk reaksi mendominasi.
Amplifikasi bagian DNA yang diinginkan: reaksi berantai polimerase
Pada masa-masa awal PCR, masalah utamanya adalah sebagai berikut: setelah setiap siklus pemanasan-pendinginan, DNA polimerase harus ditambahkan ke dalam campuran reaksi, karena DNA tersebut dinonaktifkan pada suhu 95Β°C. Oleh karena itu, perlu ditambahkan kembali sebelum masing-masing dari 25 siklus. Prosedur reaksinya relatif tidak efisien, memerlukan banyak waktu dan enzim polimerase, serta bahan yang sangat mahal. Untungnya, Ibu Pertiwi datang menyelamatkan. Banyak hewan merasa nyaman pada suhu yang jauh lebih tinggi dari 37 Β°C. Mengapa angka 37 Β°C menjadi penting bagi kami? Hal ini terjadi karena suhu tersebut optimal untuk E. coli, tempat asal enzim polimerase untuk PCR. Di alam terdapat mikroorganisme yang proteinnya, selama jutaan tahun melalui seleksi alam, menjadi lebih tahan terhadap suhu tinggi. Telah diusulkan untuk menggunakan DNA polimerase dari bakteri termofilik. Enzim-enzim ini ternyata bersifat termostabil dan mampu menahan banyak siklus reaksi. Penggunaannya memungkinkan untuk menyederhanakan dan mengotomatisasi PCR. Salah satu DNA polimerase termostabil pertama diisolasi dari bakteri Thermus Aquaticus, yang hidup di sumber air panas Taman Nasional Yellowstone, dan diberi nama Taq polimerase.
PCR dengan cepat menjadi tulang punggung Proyek Genom Manusia. Secara umum prosesnya tidak berbeda dengan yang dikembangkan Mullis, hanya saja sudah terotomatisasi. Kami tidak lagi bergantung pada sekumpulan mahasiswa pascasarjana yang bodoh yang dengan susah payah menuangkan tetesan cairan ke dalam tabung reaksi plastik. Di laboratorium modern yang melakukan penelitian genetika molekuler, pekerjaan ini dilakukan pada konveyor robot. Robot PCR yang terlibat dalam proyek pengurutan sebesar Genom Manusia bekerja tanpa henti dengan polimerase stabil panas dalam jumlah besar. Beberapa ilmuwan yang bekerja pada Proyek Genom Manusia marah dengan tingginya royalti yang ditambahkan ke biaya bahan habis pakai oleh pemilik paten PCR, raksasa farmasi industri Eropa Hoffmann-LaRoche.
βPrinsip pendorongβ lainnya adalah metode pengurutan DNA itu sendiri. Dasar kimia dari metode ini bukanlah hal baru pada saat itu: Interstate Human Genome Project (HGP) mengadopsi metode cerdik yang sama yang dikembangkan Fred Sanger pada pertengahan tahun 1970an. Inovasinya terletak pada skala dan tingkat otomatisasi yang dapat dicapai oleh pengurutan.
Pengurutan otomatis pada awalnya dikembangkan di laboratorium Lee Hood di Institut Teknologi California. Dia bersekolah di sekolah menengah di Montana dan bermain sepak bola perguruan tinggi sebagai quarterback; Berkat Hood, tim memenangkan kejuaraan negara bagian lebih dari satu kali. Keterampilan kerja tim juga berguna dalam karir ilmiahnya. Laboratorium Hood dikelola oleh sekelompok ahli kimia, biologi, dan insinyur yang beraneka ragam, dan laboratoriumnya segera menjadi pemimpin dalam inovasi teknologi.
Faktanya, metode pengurutan otomatis ditemukan oleh Lloyd Smith dan Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, yang saat itu bekerja di laboratorium Hood, mendekati Lloyd Smith dengan proposal untuk metode pengurutan yang lebih baik di mana setiap jenis basa akan diwarnai secara berbeda. Ide seperti itu bisa melipatgandakan efisiensi proses Sanger. Di Sanger, ketika diurutkan di masing-masing empat tabung (sesuai dengan jumlah basa), dengan partisipasi DNA polimerase, satu set oligonukleotida unik dengan panjang berbeda terbentuk, termasuk urutan primer. Selanjutnya, formamida ditambahkan ke tabung untuk pemisahan rantai dan elektroforesis gel poliakrilamida dilakukan pada empat jalur. Dalam versi Smith dan Hunkapiller, dideoksinukleotida diberi label dengan empat pewarna berbeda dan PCR dilakukan dalam satu tabung. Kemudian, selama elektroforesis gel poliakrilamida, sinar laser pada lokasi tertentu pada gel merangsang aktivitas pewarna, dan detektor menentukan nukleotida mana yang sedang bermigrasi melalui gel. Pada awalnya, Smith pesimis - dia khawatir penggunaan pewarna dalam dosis sangat rendah akan menyebabkan daerah nukleotida tidak dapat dibedakan. Namun, karena memiliki pemahaman yang sangat baik tentang teknologi laser, ia segera menemukan jalan keluar dari situasi tersebut dengan menggunakan pewarna fluorokrom khusus yang berpendar saat terkena radiasi laser.
(Versi lengkap - 4,08 MB) Cetakan halus: Urutan DNA diurutkan menggunakan sequencer otomatis, diperoleh dari mesin sekuensing otomatis. Setiap warna berhubungan dengan salah satu dari empat basa
Pada metode Sanger versi klasik, salah satu untai DNA yang dianalisis berperan sebagai cetakan untuk sintesis untai komplementer oleh enzim DNA polimerase, kemudian rangkaian fragmen DNA diurutkan dalam gel berdasarkan ukurannya. Setiap fragmen yang dimasukkan ke dalam DNA selama sintesis dan memungkinkan visualisasi selanjutnya dari produk reaksi diberi label dengan pewarna fluoresen yang sesuai dengan basa terminal (hal ini telah dibahas pada halaman 124); oleh karena itu, fluoresensi fragmen ini akan menjadi pengenal basa tertentu. Kemudian yang tersisa hanyalah melakukan deteksi dan memvisualisasikan produk reaksi. Hasilnya dianalisis oleh komputer dan disajikan sebagai rangkaian puncak multi-warna yang sesuai dengan empat nukleotida. Informasi tersebut kemudian ditransfer langsung ke sistem informasi komputer, menghilangkan proses entri data yang memakan waktu dan terkadang menyakitkan yang membuat pengurutan menjadi sangat sulit.
Β»Detail lebih lanjut tentang buku ini dapat ditemukan di
Β»
Β»
Untuk Khabrozhiteley diskon 25% menggunakan kupon - PCR
Sumber: www.habr.com