È morto a 74 anni in California il premio Nobel americano per la chimica Kary Mullis. Secondo quanto riferito da sua moglie, la morte è avvenuta il 7 agosto. La causa è stata insufficienza cardiaca e respiratoria a causa di polmonite.
A parlarci del suo contributo alla biochimica e del motivo per cui ha ricevuto il premio Nobel sarà lo stesso James Watson, scopritore della molecola del DNA.
Estratto dal libro di James Watson, Andrew Berry, Kevin Davies
DNA. La storia della rivoluzione genetica
Capitolo 7. Il genoma umano. Scenari di vita
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La reazione di amplificazione della polimerasi (PCR) è stata inventata nel 1983 dal biochimico Kary Mullis, che lavorava per l’azienda Cetus. La scoperta di questa reazione è stata molto notevole. In seguito, Mullis ricordò: «Una sera di venerdì nell'aprile del 1983, fui colpito da un’ispirazione. Ero al volante, stavo percorrendo una tortuosa strada montana illuminata dalla luna nel nord della California, ai confini delle foreste di sequoie». È impressionante che in una situazione del genere lo abbia colpito l'ispirazione. E non si tratta del fatto che nel nord della California ci siano strade particolari che favoriscono l'ispirazione; semplicemente, un suo amico un giorno lo vide sfrecciare imprudentemente su una strada ghiacciata con doppio senso di marcia e questo non lo disturbava affatto. Un amico ha raccontato al New York Times: «Mullis si è immaginato di morire scontrandosi con una sequoia. Perciò non ha paura mentre guida, se lungo la strada non ci sono sequoie». La presenza di sequoie lungo la strada lo costringeva a concentrarsi e… ecco l’illuminazione. Per la sua invenzione, nel 1993, Mullis ricevette il premio Nobel per la chimica e, da quel momento, divenne ancora più strano nelle sue azioni. Ad esempio, è sostenitore della teoria revisionista secondo cui l'AIDS non è legato al VIH, il che ha notevolmente danneggiato la sua reputazione e ha ostacolato i medici.
La PCR è una reazione piuttosto semplice. Per eseguirla abbiamo bisogno di due primer sintetizzati chimicamente, complementari agli estremi opposti delle diverse catene del frammento di DNA richiesto. I primer sono brevi sequenze di DNA a filamento singolo, ognuna lunga circa 20 coppie di basi. La caratteristica dei primer è che corrispondono alle regioni del DNA che devono essere amplificate, cioè al DNA-matrice.
(Immagine cliccabile) Kary Mullis, inventore della PCR
La specificità della PCR si basa sulla formazione di complessi complementari tra il matrice e i primer, brevi oligonucleotidi sintetici. Ognuno dei primer è complementare a uno dei filamenti del matrice a doppia elica e delimita l'inizio e la fine della sezione amplificabile. In effetti, il «matrice» ottenuto rappresenta un genoma intero, e il nostro obiettivo è isolare i frammenti di nostro interesse. A tal fine, il matrice di DNA a doppia elica viene riscaldato a 95 °C per alcuni minuti, in modo che i filamenti di DNA si separino. Questa fase è chiamata denaturazione, poiché si distruggono i legami idrogeno tra i due filamenti di DNA. Quando i filamenti si sono separati, la temperatura viene abbassata affinché i primer possano legarsi al matrice a singolo filamento. La DNA polimerasi inizia la replicazione del DNA, legandosi a un segmento di nucleotidi. L'enzima DNA polimerasi replica il filamento matrice, usando il primer come innesco o esempio per la copia. A seguito del primo ciclo otteniamo un duplicato consecutivo di una certa sezione di DNA. Successivamente, ripetiamo questa procedura. Dopo ogni ciclo otteniamo la sezione target in quantità doppia. Dopo venticinque cicli di PCR (cioè in meno di due ore) abbiamo la sezione di DNA di nostro interesse in una quantità 225 volte superiore a quella iniziale (cioè lo abbiamo amplificato circa 34 milioni di volte). In effetti, all'ingresso avemmo un miscuglio di primer, DNA matrice, enzima DNA polimerasi e basi libere A, C, G e T, la quantità del prodotto specifico della reazione (limitata dai primer) cresce esponenzialmente, mentre la quantità di copie
Amplificazione della sezione di DNA desiderata: reazione a catena della polimerasi
All'alba dell'uso della PCR, il problema principale era il seguente: dopo ogni ciclo di riscaldamento-raffreddamento, era necessario aggiungere alla miscela di reazione la DNA polimerasi, poiché questa si inattivava a una temperatura di 95 °C. Pertanto, dovevamo aggiungerla nuovamente prima di ciascuno dei 25 cicli. La procedura di esecuzione della reazione era relativamente inefficace, richiedeva molto tempo e l'enzima polimerasi, il quale non è affatto economico. Fortunatamente, la madre natura ci ha offerto aiuto. Molti animali si sentono a loro agio a temperature ben superiori ai 37 °C. E perché il numero 37 °C è diventato così importante per noi? È accaduto perché questa temperatura è ottimale per E. coli, da cui in origine veniva estratta l'enzima polimerasi per la PCR. In natura esistono microbi i cui proteine, dopo milioni di anni di selezione naturale, sono diventati più resistenti all'azione delle alte temperature. È stata proposta l'utilizzazione di DNA polimerasi provenienti da batteri termofili. Questi enzimi si sono rivelati termostabili e sono stati in grado di resistere a numerosi cicli di reazione. Il loro utilizzo ha semplificato e automatizzato l'esecuzione della PCR. Una delle prime DNA polimerasi termostabili è stata isolata dal batterio Thermus aquaticus, che vive nelle sorgenti calde del parco nazionale di Yellowstone, ed è stata chiamata polimerasi Taq.
La PCR è rapidamente diventata il principale cavallo di battaglia del progetto "Genoma Umano". In generale, il processo non si discosta da quello sviluppato da Mullis, è stato semplicemente automatizzato. Non eravamo più dipendenti da un gruppo di dottorandi un po' miopi, intenti a versare gocce di liquido in provette di plastica. Nei moderni laboratori di ricerca molecolare e genetica, questo lavoro viene svolto su linee di assemblaggio robotizzate. I robot PCR, impegnati in un progetto così imponente di sequenziamento come "Genoma Umano", lavorano incessantemente con enormi volumi di polimerasi termoresistente. Alcuni scienziati coinvolti nel progetto "Genoma Umano" sono rimasti indignati per le eccessive royalties che il titolare del brevetto per la PCR, il gigante europee di industria farmaceutica Hoffmann-LaRoche, aggiunge al costo dei materiali di consumo.
Un altro "motore di spinta" è stato il metodo stesso di sequenziamento del DNA. La base chimica di questo metodo non era già una novità all'epoca: il progetto intergovernativo "Genoma Umano" (HGP) ha adottato lo stesso ingegnoso metodo sviluppato da Fred Sanger a metà degli anni '70. L'innovazione risiedeva invece nella scala e nel grado di automazione raggiunti nel sequenziamento.
Il sequenziamento automatico è stato originariamente sviluppato nel laboratorio di Lee Hood al California Institute of Technology. Lui ha finito la scuola nel Montana e giocava a football americano come attaccante; grazie a Hood, la squadra ha vinto più volte il campionato statale. Le abilità di lavoro di squadra gli sono state utili anche nella carriera scientifica. Nel laboratorio di Hood lavorava una variegata compagnia di chimici, biologi e ingegneri, e presto il suo laboratorio è diventato un leader nell'innovazione tecnologica.
In effetti, il metodo di sequenziamento automatico è stato inventato da Lloyd Smith e Mike Hunzapiller. Mike Hunzapiller, che allora lavorava nel laboratorio di Hood, si rivolse a Lloyd Smith proponendogli un metodo di sequenziamento avanzato in cui le basi di ogni tipo sarebbero state colorate di ciascun colore. Questa idea avrebbe potuto aumentare l'efficienza del processo di Sanger fino a quattro volte. Nel sequenziamento di Sanger, in ognuna delle quattro provette (corrispondenti al numero delle basi) si forma un insieme unico di oligonucleotidi di lunghezze diverse, che includono la sequenza del primer, grazie all'intervento della DNA polimerasi. Successivamente, si aggiungeva formammide alle provette per separare le catene e si effettuava un'elettroforesi in gel di poliacrilammide su quattro corsie. Nella versione di Smith e Hunzapiller, i didesossinucleotidi sono marcati con quattro coloranti diversi e si esegue la PCR in una singola provetta. Durante l'elettroforesi in gel di poliacrilammide, un raggio laser in un determinato punto del gel attiva i coloranti, e il rivelatore determina quale nucleotide sta migrando attraverso il gel. All'inizio, Smith era pessimista: temeva che l'uso di dosi ultra-basse di colorante avrebbe reso indistinguibili i segmenti nucleotidici. Tuttavia, avendo una profonda conoscenza delle tecnologie laser, trovò presto una soluzione, utilizzando coloranti fluorescenti speciali che fluorescendono sotto l'irraggiamento laser.
(Versione completa — 4,08 MB) In caratteri piccoli: sequenza di DNA, decifrata utilizzando un sequenziatore automatico, ottenuta da un apparecchio per il sequenziamento automatico. Ogni colore corrisponde a una delle quattro basi.
Nella variante classica del metodo di Sanger, una delle catene di DNA analizzate funge da matrice per la sintesi di una catena complementare tramite l'enzima DNA polimerasi. Successivamente, la sequenza dei frammenti di DNA viene separata in gel in base alla dimensione. Ogni frammento che entra nella composizione del DNA durante la sintesi e consente di visualizzare in seguito i prodotti della reazione viene etichettato con un colorante fluorescente corrispondente alla base terminale (come menzionato a p. 124); pertanto, la fluorescenza di questo frammento sarà un identificatore per quella base specifica. Rimane solo da effettuare la rilevazione e visualizzare i prodotti della reazione. I risultati vengono analizzati con l'ausilio di un computer e presentati sotto forma di una sequenza di picchi multicolori, corrispondenti ai quattro nucleotidi. Successivamente, le informazioni vengono trasferite direttamente nel sistema informatico del computer, il che esclude il dispendioso e talvolta doloroso processo di immissione dati, che complicava notevolmente il sequenziamento.
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Fonte: habr.com
