È morto a 74 anni in California il premio Nobel americano per la chimica Kary Mullis. Secondo quanto riportato dalla moglie, la morte è avvenuta il 7 agosto. La causa è stata insufficienza cardiaca e respiratoria a causa di una polmonite.
James Watson, il primo scopritore della molecola del DNA, ci parlerà del contributo che ha dato alla biochimica e del motivo per cui ha ricevuto il Premio Nobel.
Estratto dal libro di James Watson, Andrew Berry, Kevin Davies
DNA. Storia della rivoluzione genetica
Capitolo 7. Il genoma umano. Scenari di vita
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La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata inventata nel 1983 dal biochimico Kary Mullis, che lavorava per la società Cetus. La scoperta di questa reazione è stata davvero notevole. In seguito, Mullis ricordava: «Un venerdì sera di aprile 1983 fui sopraffatto da un’illuminazione. Ero alla guida, percorrevo una tortuosa strada di montagna illuminata dalla luna nella California settentrionale, ai piedi delle sequoie». È impressionante che l'ispirazione lo abbia colto proprio in una simile situazione. E non si tratta affatto di strade straordinarie nel nord della California che favoriscono l'illuminazione; semplicemente un suo amico una volta lo vide sfrecciare senza paura su una strada ghiacciata con doppio senso di marcia e questo non lo turbava affatto. L'amico ha raccontato al New York Times: «Mullis aveva la visione di un incidente mortale contro una sequoia. Per questo non teme nulla alla guida, a patto che lungo la strada non crescano sequoie». La presenza di sequoie lungo la strada lo spingeva a concentrarsi e… ecco l'illuminazione. Per la sua invenzione, nel 1993, Mullis ricevette il Premio Nobel per la chimica e da allora divenne ancora più eccentrici nelle sue azioni. Ad esempio, è sostenitore di una teoria revisionista secondo cui l'AIDS non è correlato all'HIV, il che ha notevolmente minato la sua reputazione e ostacolato i medici.
La PCR è una reazione piuttosto semplice. Per realizzarla abbiamo bisogno di due primer sintetizzati chimicamente, complementari alle estremità opposte di catene diverse del frammento di DNA richiesto. I primer sono brevi segmenti di DNA a singolo filamento, ognuno lungo circa 20 paia di basi. La caratteristica dei primer è che corrispondono alle sezioni di DNA che devono essere amplificate, ovvero al DNA matrice.
(Immagine cliccabile) Kary Mullis, inventore della PCR
La specificità della PCR si basa sulla formazione di complessi complementari tra il template e i primer, corti oligonucleotidi sintetici. Ognuno dei primer è complementare a una delle catene del template a doppia elica e definisce l'inizio e la fine della regione amplificata. In effetti, il template ottenuto rappresenta un genoma integro, e il nostro obiettivo è estrarre frammenti di nostro interesse. Per fare ciò, il template di DNA a doppia elica viene riscaldato a 95 °C per alcuni minuti, in modo che le catene di DNA si separino. Questa fase è chiamata denaturazione, poiché si rompono i legami idrogeno tra le due catene di DNA. Quando le catene si sono separate, la temperatura viene abbassata affinché i primer possano legarsi al template a singola elica. La DNA polimerasi inizia la replicazione del DNA, legandosi a un segmento della catena di nucleotidi. L'enzima DNA polimerasi replica la catena template, utilizzando il primer come innesco o modello per la copia. Alla fine del primo ciclo otteniamo un raddoppiamento sequenziale del segmento specifico di DNA. Procediamo quindi a ripetere questa procedura. Dopo ogni ciclo otteniamo una quantità doppia della regione target. Dopo venticinque cicli di PCR (cioè in meno di due ore), abbiamo la regione di DNA di nostro interesse in una quantità 225 volte superiore a quella iniziale (cioè l'abbiamo amplificata circa 34 milioni di volte). In effetti, all'ingresso abbiamo una miscela di primer, DNA template, enzima DNA polimerasi e basi libere A, C, G e T; la quantità di prodotto specifico della reazione (limitato dai primer) cresce esponenzialmente, mentre la quantità di copie 'lunghe' di DNA cresce linearmente, quindi nei prodotti della reazione predominano.
Amplificazione della sezione desiderata del DNA: reazione a catena della polimerasi
All'inizio dell'uso della PCR, il problema principale era il seguente: dopo ogni ciclo di riscaldamento e raffreddamento, era necessario aggiungere la DNA polimerasi alla miscela di reazione, poiché si inattivava a 95 °C. Pertanto, bisognava reinserirla prima di ciascuno dei 25 cicli. La procedura era relativamente inefficace, richiedeva molto tempo e la polimerasi era un materiale piuttosto costoso. Fortunatamente, la natura ha dato una mano. Molti animali si sentono a loro agio a temperature molto superiori a 37 °C. Ma perché ci è sembrato importante il numero 37 °C? Ciò è avvenuto perché questa temperatura è ottimale per l'E. coli, da cui inizialmente era stata ottenuta la polimerasi per la PCR. In natura esistono microorganismi i cui proteine, grazie a milioni di anni di selezione naturale, sono diventati più resistenti alle alte temperature. È stata proposta l'utilizzazione di DNA polimerasi provenienti da batteri termofili. Questi enzimi si sono rivelati termostabili e in grado di sopportare numerosi cicli di reazione. Il loro utilizzo ha permesso di semplificare e automatizzare la conduzione della PCR. Una delle prime DNA polimerasi termostabili è stata isolata dal batterio Thermus aquaticus, che vive nelle sorgenti termali del Parco Nazionale di Yellowstone, ed è stata chiamata polimerasi Taq.
La PCR è rapidamente diventata il cavallo di battaglia del progetto "Genoma umano". In generale, il processo non differisce da quello sviluppato da Mullis, ma è stato automatizzato. Non eravamo più dipendenti da una folla di assistenti ciechi che versavano con attenzione gocce di liquido in provette di plastica. Nelle moderne laboratori, che conducono ricerche molecolare-genetiche, questo lavoro viene svolto su conveyor automatizzati. I robot PCR, impiegati in un progetto così vasto di sequenziamento come il "Genoma umano", lavorano instancabilmente con enormi quantità di polimerasi termostabile. Alcuni scienziati coinvolti nel progetto "Genoma umano" erano indignati per le spese ingiustificatamente elevate aggiunte al costo dei materiali di consumo dal proprietario del brevetto della PCR, il gigante europeo dell'industria farmaceutica Hoffmann-LaRoche.
Un altro 'motore' fondamentale è stato il metodo di sequenziamento del DNA. La base chimica di questo metodo non era già una novità: il progetto internazionale 'Genoma Umano' (HGP) aveva adottato lo stesso astuto metodo sviluppato da Fred Sanger a metà degli anni '70. L'innovazione stava nella scala e nel livello di automazione che sono stati raggiunti durante il sequenziamento.
Il sequenziamento automatico è stato originariamente sviluppato nel laboratorio di Lee Hood al California Institute of Technology. Lui ha finito la scuola nel Montana e giocava a football americano come tight end; grazie a Hood, la squadra ha vinto più volte il campionato statale. Le abilità di teamwork gli sono tornate utili anche nella carriera scientifica. Nel laboratorio di Hood lavorava un variegato gruppo di chimici, biologi e ingegneri, e presto il suo laboratorio è diventato un leader nell'innovazione tecnologica.
In effetti, il metodo di sequenziamento automatico è stato inventato da Lloyd Smith e Mike Hunakapiller. Mike Hunakapiller, che all'epoca lavorava nel laboratorio di Hood, si è rivolto a Lloyd Smith proponendogli un metodo di sequenziamento avanzato in cui le basi di ciascun tipo sarebbero state colorate in modo diverso. Questa idea avrebbe potuto aumentare l'efficienza del processo di Sanger di quattro volte. Nel metodo di Sanger, durante il sequenziamento, in ciascuno dei quattro tubi (corrispondenti ai quattro nucleotidi) si forma un insieme unico di oligonucleotidi di lunghezza variabile con una sequenza primer, grazie all'azione della DNA polimerasi. Successivamente, si aggiungeva al tubo il formamide per la denaturazione delle catene e si eseguiva l'elettroforesi in gel di poliacrilammide su quattro bande. Nella variante di Smith e Hunakapiller, i didesossinucleotidi venivano contrassegnati con quattro coloranti diversi e veniva eseguita una PCR in un solo tubo. Poi, durante l'elettroforesi nel gel di poliacrilammide, un raggio laser in un punto specifico del gel attivava l'attività dei coloranti, e il rilevatore determinava quale nucleotide stava attualmente migrando attraverso il gel. Inizialmente, Smith era piuttosto pessimista: temeva che l'uso di dosi estremamente piccole di colorante avrebbe reso indistinguibili i frammenti nucleotidici. Tuttavia, avendo una grande conoscenza delle tecnologie laser, riuscì presto a trovare una soluzione utilizzando coloranti fluorocromici speciali che fluorescono sotto l'azione della radiazione laser.
(Versione completa — 4,08 MB) In piccolo: sequenza di DNA, decifrata utilizzando un sequenziatore automatico, ottenuta da un dispositivo di sequenziamento automatico. Ogni colore corrisponde a una delle quattro basi
Nella variante classica del metodo di Sanger, una delle catene di DNA analizzato funge da matrice per la sintesi di una catena complementare da parte dell'enzima DNA-polimerasi, quindi la sequenza dei frammenti di DNA viene separata in un gel in base alle dimensioni. Ogni frammento, che viene incorporato nel DNA durante la sintesi e consente di visualizzare successivamente i prodotti della reazione, viene contrassegnato con un colorante fluorescente corrispondente alla base terminale (di cui si è parlato a pagina 124); pertanto, la fluorescenza di questo frammento sarà un identificatore per quella specifica base. Resta quindi solo da rilevare e visualizzare i prodotti della reazione. I risultati vengono analizzati tramite computer e presentati sotto forma di sequenze di picchi colorati, corrispondenti ai quattro nucleotidi. Successivamente, le informazioni vengono trasmesse direttamente al sistema informativo del computer, eliminando il dispendioso e talvolta frustrante processo di immissione dati che complicava notevolmente il sequenziamento.
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Fonte: habr.com
