Il premio Nobel americano per la chimica Kary Mullis è morto in California all'età di 74 anni. Secondo la moglie la morte è avvenuta il 7 agosto. La causa è l’insufficienza cardiaca e respiratoria dovuta alla polmonite.
Lo stesso James Watson, lo scopritore della molecola del DNA, ci racconterà il suo contributo alla biochimica e per il quale ha ricevuto il Premio Nobel.
Estratto dal libro di James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Storia della rivoluzione genetica
Capitolo 7. Genoma umano. Scenario di vita
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La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata inventata nel 1983 dal biochimico Carey Mullis, che lavorava alla Cetus. La scoperta di questa reazione è stata davvero notevole. Mullis in seguito ricordò: “Un venerdì sera dell'aprile 1983 ebbi un'illuminazione. Ero al volante, percorrevo una tortuosa strada di montagna illuminata dalla luna nel nord della California, la terra delle foreste di sequoie. È impressionante che sia stato in una situazione del genere che l'ispirazione lo abbia colpito. E non è che la California settentrionale abbia strade speciali che promuovono la comprensione; è solo che una volta il suo amico ha visto Mullis sfrecciare incautamente lungo una strada ghiacciata a doppia carreggiata e la cosa non gli ha dato alcun fastidio. Un amico ha detto al New York Times: “Mullis aveva una visione in cui sarebbe morto schiantandosi contro un albero di sequoia. Pertanto, non ha paura di nulla mentre guida, a meno che non ci siano alberi di sequoia che crescono lungo la strada. La presenza di sequoie lungo la strada costrinse Mullis a concentrarsi e... eccola qui, un'intuizione. Mullis ha ricevuto il Premio Nobel per la Chimica per la sua invenzione nel 1993 e da allora le sue azioni sono diventate ancora più strane. Ad esempio, è un sostenitore della teoria revisionista secondo cui l'AIDS non è correlato all'HIV, il che ha minato in modo significativo la sua stessa reputazione e ha interferito con i medici.
La PCR è una reazione abbastanza semplice. Per realizzarlo, abbiamo bisogno di due primer sintetizzati chimicamente che siano complementari alle estremità opposte di diversi filamenti del frammento di DNA richiesto. I primer sono brevi sezioni di DNA a filamento singolo, ciascuna lunga circa 20 paia di basi. La particolarità dei primer è che corrispondono alle sezioni di DNA che necessitano di essere amplificate, cioè al DNA template.
(Immagine cliccabile) Kary Mullis, inventore della PCR
La specificità della PCR si basa sulla formazione di complessi complementari tra template e primer, brevi oligonucleotidi sintetici. Ciascun primer è complementare a uno dei filamenti del modello a doppio filamento e limita l'inizio e la fine della regione amplificata. In effetti, la “matrice” risultante è un intero genoma e il nostro obiettivo è isolare da esso i frammenti di nostro interesse. Per fare ciò, lo stampo di DNA a doppio filamento viene riscaldato a 95 °C per diversi minuti per separare i filamenti di DNA. Questa fase è chiamata denaturazione perché i legami idrogeno tra i due filamenti di DNA vengono rotti. Una volta che i filamenti si sono separati, la temperatura viene abbassata per consentire ai primer di legarsi al modello a filamento singolo. La DNA polimerasi inizia la replicazione del DNA legandosi ad un tratto di catena nucleotidica. L'enzima DNA polimerasi replica il filamento modello utilizzando un primer come primer o esempio per la copia. Come risultato del primo ciclo, otteniamo il raddoppio sequenziale multiplo di una determinata sezione del DNA. Successivamente ripetiamo questa procedura. Dopo ogni ciclo otteniamo un'area target in quantità doppia. Dopo venticinque cicli di PCR (cioè in meno di due ore), abbiamo la regione del DNA che ci interessa in una quantità 225 volte superiore all'originale (cioè l'abbiamo amplificata circa 34 milioni di volte). Infatti, in ingresso riceviamo una miscela di primer, DNA stampo, l'enzima DNA polimerasi e le basi libere A, C, G e T, la quantità di uno specifico prodotto di reazione (limitato dai primer) cresce esponenzialmente, e il numero Il numero di copie di DNA “lunghe” è lineare, quindi nei prodotti di reazione prevale.
Amplificazione della sezione di DNA desiderata: reazione a catena della polimerasi
Agli albori della PCR, il problema principale era il seguente: dopo ogni ciclo di riscaldamento-raffreddamento, la DNA polimerasi doveva essere aggiunta alla miscela di reazione, poiché veniva inattivata ad una temperatura di 95°C. Pertanto è stato necessario aggiungerlo nuovamente prima di ciascuno dei 25 cicli. La procedura di reazione era relativamente inefficiente, richiedeva molto tempo e l'enzima polimerasi e il materiale era molto costoso. Per fortuna, Madre Natura è venuta in soccorso. Molti animali si sentono a proprio agio a temperature molto superiori a 37 °C. Perché il valore 37°C è diventato importante per noi? Ciò è accaduto perché questa temperatura è ottimale per l'E. coli, da cui è stato originariamente ottenuto l'enzima polimerasi per la PCR. In natura esistono microrganismi le cui proteine, nel corso di milioni di anni di selezione naturale, sono diventate più resistenti alle alte temperature. È stato proposto di utilizzare DNA polimerasi di batteri termofili. Questi enzimi si sono rivelati termostabili e in grado di resistere a molti cicli di reazione. Il loro utilizzo ha permesso di semplificare e automatizzare la PCR. Una delle prime DNA polimerasi termostabili fu isolata dal batterio Thermus acquatico, che vive nelle sorgenti termali del Parco Nazionale di Yellowstone, e fu chiamata Taq polimerasi.
La PCR divenne rapidamente il cavallo di battaglia del Progetto Genoma Umano. In generale il processo non è diverso da quello sviluppato da Mullis, è solo stato automatizzato. Non dipendevamo più da una folla di studenti laureati ottusi che versavano faticosamente goccioline di liquido in provette di plastica. Nei moderni laboratori che effettuano ricerche di genetica molecolare, questo lavoro viene eseguito su trasportatori robotizzati. I robot PCR coinvolti in un progetto di sequenziamento grande quanto il genoma umano lavorano incessantemente con enormi volumi di polimerasi termostabile. Alcuni scienziati che lavorano al Progetto Genoma Umano sono rimasti indignati per le royalties irragionevolmente elevate aggiunte al costo dei materiali di consumo dal proprietario del brevetto PCR, il gigante farmaceutico industriale europeo Hoffmann-LaRoche.
Un altro “principio trainante” era il metodo stesso di sequenziamento del DNA. La base chimica di questo metodo non era più nuova a quel tempo: l’Interstate Human Genome Project (HGP) adottò lo stesso metodo ingegnoso che Fred Sanger aveva sviluppato a metà degli anni ’1970. L'innovazione risiedeva nella portata e nel grado di automazione che il sequenziamento era in grado di raggiungere.
Il sequenziamento automatizzato è stato originariamente sviluppato nel laboratorio di Lee Hood presso il California Institute of Technology. Ha frequentato il liceo nel Montana e ha giocato a football universitario come quarterback; Grazie a Hood, la squadra ha vinto più di una volta il campionato statale. Le sue capacità di lavoro di squadra si sono rivelate utili anche nella sua carriera scientifica. Il laboratorio di Hood era composto da un gruppo eterogeneo di chimici, biologi e ingegneri, e il suo laboratorio divenne presto leader nell'innovazione tecnologica.
In effetti, il metodo di sequenziamento automatizzato è stato inventato da Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, che allora lavorava nel laboratorio di Hood, si rivolse a Lloyd Smith con una proposta per un metodo di sequenziamento migliorato in cui ogni tipo di base sarebbe stato colorato in modo diverso. Un’idea del genere potrebbe quadruplicare l’efficienza del processo Sanger. In Sanger, quando si sequenzia in ciascuna delle quattro provette (in base al numero di basi), con la partecipazione della DNA polimerasi, si forma un insieme unico di oligonucleotidi di diversa lunghezza, inclusa una sequenza di primer. Successivamente, la formammide è stata aggiunta ai tubi per la separazione della catena e l'elettroforesi su gel di poliacrilammide è stata eseguita su quattro corsie. Nella versione di Smith e Hunkapiller, i dideossinucleotidi sono marcati con quattro coloranti diversi e la PCR viene eseguita in un'unica provetta. Quindi, durante l'elettroforesi su gel di poliacrilammide, un raggio laser in una posizione specifica sul gel eccita l'attività dei coloranti e il rilevatore determina quale nucleotide sta attualmente migrando attraverso il gel. All'inizio Smith era pessimista: temeva che l'uso di dosi estremamente basse di colorante avrebbe portato le regioni nucleotidiche a essere indistinguibili. Tuttavia, avendo un'ottima conoscenza della tecnologia laser, trovò presto una via d'uscita dalla situazione utilizzando speciali coloranti fluorocromici che diventano fluorescenti se esposti alla radiazione laser.
(Versione completa - 4,08 MB) Stampa fine: sequenza di DNA sequenziata utilizzando un sequenziatore automatico, ottenuto da una macchina di sequenziamento automatica. Ogni colore corrisponde a una delle quattro basi
Nella versione classica del metodo Sanger, uno dei filamenti del DNA analizzato funge da modello per la sintesi di un filamento complementare da parte dell'enzima DNA polimerasi, quindi la sequenza di frammenti di DNA viene ordinata in un gel per dimensione. Ogni frammento, che viene incluso nel DNA durante la sintesi e consente la successiva visualizzazione dei prodotti della reazione, è marcato con un colorante fluorescente in corrispondenza della base terminale (di questo si è parlato a pag. 124); pertanto, la fluorescenza di questo frammento sarà un identificatore per una determinata base. Quindi non resta che eseguire il rilevamento e visualizzare i prodotti della reazione. I risultati vengono analizzati dal computer e presentati come una sequenza di picchi multicolori corrispondenti a quattro nucleotidi. Le informazioni vengono quindi trasferite direttamente al sistema informativo del computer, eliminando il lungo e talvolta doloroso processo di immissione dei dati che rendeva molto difficile il sequenziamento.
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Fonte: habr.com