חתן פרס נובל קארי מוליס, ממציא תגובת שרשרת ה-DNA פולימראז, מת

חתן פרס נובל אמריקאי לכימיה קארי מוליס מת בקליפורניה בגיל 74. לדברי אשתו, המוות אירע ב-7 באוגוסט. הסיבה היא אי ספיקת לב ונשימה עקב דלקת ריאות.

ג'יימס ווטסון עצמו, מגלה מולקולת ה-DNA, יספר לנו על תרומתו לביוכימיה ועליה קיבל את פרס נובל.

קטע מתוך הספר מאת ג'יימס ווטסון, אנדרו ברי, קווין דייויס

DNA. היסטוריה של המהפכה הגנטית

פרק 7. הגנום האנושי. תרחיש חיים

...
תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) הומצאה ב-1983 על ידי הביוכימאית קארי מוליס, שעבדה ב-Cetus. גילוי התגובה הזו היה מדהים למדי. מאוחר יותר נזכר מוליס: "ערב שישי אחד באפריל 1983, הייתה לי התגלות. הייתי מאחורי ההגה, נסעתי בכביש הררי מפותל מואר ירח בצפון קליפורניה, ארץ יערות הסקויה". מרשים שדווקא במצב כזה הכתה בו ההשראה. וזה לא שבצפון קליפורניה יש כבישים מיוחדים שמקדמים תובנה; רק שחבר שלו ראה פעם את מוליס דוהר בפזיזות לאורך כביש כפול קפוא וזה לא הפריע לו בכלל. חבר אמר לניו יורק טיימס: "למוליס היה חזון שהוא ימות בהתרסקות בעץ סקויה. לכן הוא לא מפחד מכלום בזמן נהיגה, אלא אם כן צומחים עצי סקויה לאורך הכביש". נוכחותם של עצי סקויה לאורך הכביש אילצה את מוליס להתרכז ו... הנה זה היה, תובנה. מוליס קיבל את פרס נובל בכימיה על המצאתו ב-1993 ומאז הפך זר עוד יותר במעשיו. לדוגמה, הוא תומך בתיאוריה הרוויזיוניסטית לפיה איידס אינו קשור ל-HIV, דבר שערער משמעותית את המוניטין שלו והפריע לרופאים.

PCR היא תגובה פשוטה למדי. כדי לבצע את זה, אנחנו צריכים שני פריימרים מסונתזים כימית המשלימים לקצוות הנגדיים של גדילים שונים של שבר ה-DNA הנדרש. פריימרים הם קטעים קצרים של DNA חד-גדילי, כל אחד באורך של כ-20 זוגות בסיסים. המוזרות של פריימרים היא שהם תואמים לקטעי ה-DNA שצריך להגביר, כלומר, תבנית ה-DNA.

(ניתן ללחוץ על התמונה) קארי מוליס, ממציא PCR

הספציפיות של PCR מבוססת על היווצרות קומפלקסים משלימים בין התבנית והפריימרים, אוליגונוקלאוטידים סינתטיים קצרים. כל אחד מהפריימרים משלים לאחד מהגדילים של התבנית הדו-גדילית ומגביל את ההתחלה והסוף של האזור המוגבר. למעשה, ה"מטריקס" שנוצר הוא גנום שלם, והמטרה שלנו היא לבודד ממנו את השברים המעניינים אותנו. לשם כך, תבנית ה-DNA הדו-גדילית מחוממת ל-95 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות כדי להפריד את גדילי ה-DNA. שלב זה נקרא דנטורציה מכיוון שקשרי המימן בין שני גדילי ה-DNA נשברים. לאחר שהגדילים נפרדו, הטמפרטורה יורדת כדי לאפשר לפריימרים להיקשר לתבנית החד-גדילית. DNA פולימראז מתחיל את שכפול ה-DNA על ידי קשירה למתיחה של שרשרת נוקלאוטידים. האנזים DNA פולימראז משכפל את גדיל התבנית באמצעות פריימר בתור פריימר או דוגמה להעתקה. כתוצאה מהמחזור הראשון, אנו מקבלים הכפלה רציפה מרובה של קטע DNA מסוים. לאחר מכן נחזור על הליך זה. לאחר כל מחזור נקבל אזור יעד בכמות כפולה. לאחר עשרים וחמישה מחזורי PCR (כלומר תוך פחות משעתיים), יש לנו את אזור ה-DNA שמעניין אותנו בכמות הגבוהה פי 225 מהמקור (כלומר, הגבירנו אותו בערך פי 34 מיליון). למעשה, בקלט קיבלנו תערובת של פריימרים, תבנית DNA, אנזים DNA פולימראז ובסיסים חופשיים A, C, G ו-T, הכמות של תוצר תגובה ספציפי (מוגבל על ידי הפריימרים) גדלה באופן אקספוננציאלי, והמספר של עותקי DNA "ארוכים" הוא ליניארי, כך שבתגובה תוצרים שולטים.

הגברה של קטע ה-DNA הרצוי: תגובת שרשרת פולימראז

בימים הראשונים של PCR, הבעיה העיקרית הייתה הבאה: לאחר כל מחזור חימום-קירור, היה צורך להוסיף DNA פולימראז לתערובת התגובה, מכיוון שהיא הושבתה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. לכן, היה צורך להוסיף אותו מחדש לפני כל אחד מ-25 המחזורים. הליך התגובה היה יחסית לא יעיל, דרש הרבה זמן ואת האנזים פולימראז, והחומר היה יקר מאוד. למרבה המזל, אמא טבע באה לעזרה. בעלי חיים רבים מרגישים בנוח בטמפרטורות גבוהות בהרבה מ-37 מעלות צלזיוס. מדוע הנתון 37 מעלות צלזיוס הפך חשוב עבורנו? זה קרה מכיוון שהטמפרטורה הזו אופטימלית עבור E. coli, שממנו התקבל במקור אנזים הפולימראז ל-PCR. בטבע ישנם מיקרואורגניזמים שהחלבונים שלהם, במשך מיליוני שנים של ברירה טבעית, הפכו עמידים יותר לטמפרטורות גבוהות. הוצע להשתמש בפולימראזות DNA מחיידקים תרמופילים. אנזימים אלה התבררו כיציבים תרמיים והיו מסוגלים לעמוד במחזורי תגובה רבים. השימוש בהם איפשר לפשט ולהפוך את ה-PCR לאוטומטי. אחד מפולימראזות ה-DNA התרמו-יציבות הראשונות בודד מהחיידק Thermus aquaticus, שחי במעיינות החמים של הפארק הלאומי ילוסטון, וזכה לשם Taq polymerase.

PCR הפך במהירות לסוס העבודה של פרויקט הגנום האנושי. באופן כללי, התהליך אינו שונה מזה שפיתח מוליס, הוא פשוט עבר אוטומטית. כבר לא היינו תלויים בקהל של סטודנטים אפלוליים לתואר שני ששפכו בקפידה טיפות נוזל לתוך מבחנות פלסטיק. במעבדות מודרניות המבצעות מחקר גנטי מולקולרי, עבודה זו מתבצעת על מסועים רובוטיים. רובוטי PCR המעורבים בפרויקט רצף גדול כמו הגנום האנושי עובדים ללא הפוגה עם נפחים עצומים של פולימראז יציב בחום. כמה מדענים שעבדו על פרויקט הגנום האנושי זעמו על התמלוגים הגבוהים באופן בלתי סביר שנוספו לעלות החומרים המתכלים על ידי הבעלים של פטנט PCR, ענקית התרופות התעשייתית האירופית הופמן-לרוש.

"עקרון מניע" נוסף היה שיטת רצף ה-DNA עצמה. הבסיס הכימי של שיטה זו כבר לא היה חדש באותה תקופה: פרויקט הגנום האנושי הבין-מדינתי (HGP) אימץ את אותה שיטה גאונית שפיתח פרד סנגר עוד באמצע שנות ה-1970. החידוש טמון בקנה המידה ובמידת האוטומציה שהצליחה הרצף להשיג.

רצף אוטומטי פותח במקור במעבדה של לי הוד במכון הטכנולוגי של קליפורניה. הוא למד בתיכון במונטנה ושיחק פוטבול בקולג' כקוורטרבק; בזכות הוד, הקבוצה זכתה באליפות המדינה יותר מפעם אחת. כישורי עבודת הצוות שלו הועילו גם בקריירה המדעית שלו. המעבדה של הוד הייתה מאוישת על ידי צוות ססגוני של כימאים, ביולוגים ומהנדסים, והמעבדה שלו הפכה במהרה למובילה בחדשנות טכנולוגית.

למעשה, שיטת הרצף האוטומטית הומצאה על ידי לויד סמית' ומייק הונקאפילר. מייק הונקאפילר, שעבד אז במעבדה של הוד, פנה ללויד סמית' עם הצעה לשיטת רצף משופרת שבה כל סוג של בסיס יצבע בצורה שונה. רעיון כזה יכול להכפיל פי ארבעה את היעילות של תהליך סנגר. בסנג'ר, כאשר עושים רצף בכל אחת מארבעה צינורות (לפי מספר הבסיסים), בהשתתפות DNA פולימראז, נוצרת קבוצה ייחודית של אוליגונוקלאוטידים באורכים שונים, כולל רצף פריימר. לאחר מכן, פורמאמיד נוסף לצינורות להפרדת שרשרת ובוצע אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד בארבעה נתיבים. בגרסה של סמית' והונקאפילר, דידיאוקסינוקלאוטידים מסומנים בארבעה צבעים שונים ו-PCR מבוצע בשפופרת אחת. לאחר מכן, במהלך אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, קרן לייזר במיקום מסוים על הג'ל מעוררת את פעילות הצבעים, והגלאי קובע איזה נוקלאוטיד נודד כעת דרך הג'ל. בהתחלה, סמית' היה פסימי - הוא חשש ששימוש במינונים נמוכים במיוחד של צבע יוביל לכך שלא ניתן יהיה להבחין בין אזורי הנוקלאוטידים. עם זאת, עם הבנה מצוינת של טכנולוגיית הלייזר, הוא מצא במהרה דרך לצאת מהמצב על ידי שימוש בצבעי פלואורכרום מיוחדים הפורחים כאשר הם נחשפים לקרינת לייזר.

(גרסה מלאה על ידי קליק - 4,08 מגה-בייט) אותיות קטנות: רצף DNA המרוצף באמצעות רצף אוטומטי, המתקבל ממכונת רצף אוטומטית. כל צבע מתאים לאחד מארבעה בסיסים

בגרסה הקלאסית של שיטת סנגר, אחד הגדילים של ה-DNA המנותח משמש כתבנית לסינתזה של גדיל משלים על ידי האנזים DNA פולימראז, ואז רצף שברי ה-DNA ממוין בג'ל לפי גודל. כל שבר, הנכלל ב-DNA במהלך הסינתזה ומאפשר הדמיה לאחר מכן של תוצרי תגובה, מסומן בצבע ניאון המתאים לבסיס הטרמינל (הדבר נדון בעמ' 124); לפיכך, הקרינה של קטע זה תהיה מזהה עבור בסיס נתון. לאחר מכן כל שנותר הוא לבצע איתור ולדמיין את תוצרי התגובה. התוצאות מנותחות על ידי מחשב ומוצגות כרצף של פסגות רב-צבעוניות המקבילות לארבעה נוקלאוטידים. לאחר מכן, המידע מועבר ישירות למערכת המידע של המחשב, ומבטל את תהליך הזנת הנתונים שגוזל זמן רב ולעיתים כואב שהקשה מאוד על הרצף.

» פרטים נוספים על הספר ניתן למצוא בכתובת אתר האינטרנט של ההוצאה לאור
» תוכן העניינים
» קטע

עבור Khabrozhiteley 25% הנחה באמצעות קופון - PCR

מקור: www.habr.com