ノーベル賞受賞者、DNAポリメラーゼ連鎖反応の発明者、キャリー・マリス氏が死去

アメリカのノーベル化学賞受賞者、キャリー・マリス氏がカリフォルニアで74歳で死去した。 妻によると、死亡したのは7月XNUMX日だったという。 原因は肺炎による心不全と呼吸不全です。

DNA 分子の発見者であるジェームズ ワトソン自身が、生化学への貢献とその功績によりノーベル賞を受賞したことについて語ります。

ジェームズ・ワトソン、アンドリュー・ベリー、ケビン・デイビス著の本からの抜粋

DNA。 遺伝子革命の歴史

第 7 章 ヒトゲノム。 人生のシナリオ

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ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、Cetus で働いていた生化学者のキャリー マリスによって 1983 年に発明されました。 この反応の発見は非常に注目に値するものでした。 マリスは後にこう回想している。「1983年1993月のある金曜日の夕方、私はひらめきました。 私はハンドルを握って、セコイアの森の国、北カリフォルニアの月明かりに照らされた曲がりくねった山道を運転していました。」 そんな状況でインスピレーションが湧いたのが印象的だ。 そして、北カリフォルニアには洞察力を高める特別な道路があるわけではありません。 ただ、彼の友人はマリスが氷の二輪車道を無謀にスピードを上げているのを見たことがあったが、彼はまったく気にならなかったというだけだ。 友人はニューヨーク・タイムズに次のように語った。「マリスはセコイアの木に激突して死ぬというビジョンを持っていた。 したがって、道路沿いにセコイアの木が生えていない限り、運転中は何も恐れることはありません。」 道路沿いのセコイアの存在により、マリスは集中力を高め、そして...ここで洞察力が得られました。 マリスはXNUMX年にその発明でノーベル化学賞を受賞したが、それ以来彼の行動はさらに奇妙になっている。 たとえば、彼はエイズは HIV とは無関係であるという修正主義理論の支持者であり、この理論は彼自身の評判を著しく傷つけ、医師に干渉しました。

PCRは非常に単純な反応です。 これを実行するには、必要な DNA フラグメントの異なる鎖の反対側の末端に相補的な 20 つの化学合成プライマーが必要です。 プライマーは一本鎖 DNA の短いセクションであり、それぞれの長さは約 XNUMX 塩基対です。 プライマーの特徴は、増幅する必要がある DNA セクション、つまり DNA テンプレートに対応していることです。

(画像をクリック可能) PCR の発明者、キャリー・マリス

PCR の特異性は、テンプレートとプライマー、短い合成オリゴヌクレオチドの間の相補的複合体の形成に基づいています。 各プライマーは二本鎖テンプレートの一方の鎖に相補的であり、増幅領域の始まりと終わりを制限します。 実際、結果として得られる「マトリックス」はゲノム全体であり、私たちの目標はそこから興味のある断片を分離することです。 これを行うには、二本鎖 DNA テンプレートを 95 °C で数分間加熱して DNA 鎖を分離します。 225 本の DNA 鎖間の水素結合が切断されるため、この段階は変性と呼ばれます。 鎖が分離したら、温度を下げてプライマーを一本鎖テンプレートに結合させます。 DNA ポリメラーゼは、一連のヌクレオチド鎖に結合することによって DNA 複製を開始します。 酵素DNAポリメラーゼは、プライマーまたはコピーの例としてプライマーを使用して鋳型鎖を複製します。 最初のサイクルの結果として、特定の DNA セクションの複数の連続した倍加が得られます。 次にこの手順を繰り返します。 各サイクルの後、ターゲット領域を 34 倍の量で取得します。 XNUMX 回の PCR サイクル後 (つまり XNUMX 時間未満)、元の DNA の XNUMX 倍の量の目的の DNA 領域が得られます (つまり、約 XNUMX 万回増幅したことになります)。 実際、入力時にプライマー、テンプレート DNA、DNA ポリメラーゼ酵素、遊離塩基 A、C、G、T の混合物を受け取りました。特定の反応生成物の量 (プライマーによって制限される) は指数関数的に増加し、その数は増加します。 「長い」DNA コピーの割合は直線的であるため、反応では生成物が優勢になります。

目的の DNA セクションの増幅: ポリメラーゼ連鎖反応

PCR の初期の主な問題は次のとおりでした。DNA ポリメラーゼは 95 ℃ の温度で不活化されるため、各加熱冷却サイクルの後に反応混合物に添加する必要がありました。 したがって、25 サイクルのそれぞれの前に再添加する必要がありました。 反応手順は比較的非効率で、多くの時間とポリメラーゼ酵素を必要とし、材料は非常に高価でした。 幸運なことに、母なる自然が助けてくれました。 多くの動物は、37 °C よりもはるかに高い温度で快適に感じます。 なぜ 37 °C という数字が私たちにとって重要なのでしょうか? これは、この温度が、PCR 用のポリメラーゼ酵素が最初に得られた大腸菌にとって最適な温度であるためです。 自然界には、何百万年にもわたる自然選択を経て、そのタンパク質が高温に対する耐性を高めた微生物が存在します。 好熱性細菌由来の DNA ポリメラーゼを使用することが提案されています。 これらの酵素は熱安定性があり、多くの反応サイクルに耐えられることが判明しました。 これらを使用することで、PCR を簡素化および自動化することが可能になりました。 最初の熱安定性 DNA ポリメラーゼの XNUMX つは、イエローストーン国立公園の温泉に生息する細菌 Thermus aquaticus から単離され、Taq ポリメラーゼと名付けられました。

PCR はすぐにヒトゲノム プロジェクトの主力となりました。 一般に、このプロセスは Mullis が開発したプロセスと何ら変わりはなく、自動化されただけです。 私たちはもはや、プラスチックの試験管に液体の滴を苦労して注ぎ込む、頭の悪い大学院生の群れに依存する必要はありませんでした。 分子遺伝学的研究を行う現代の研究室では、この作業はロボットコンベア上で行われます。 ヒトゲノムほどの大規模な配列決定プロジェクトに関与する PCR ロボットは、大量の熱安定性ポリメラーゼを絶え間なく処理します。 ヒトゲノム計画に取り組んでいる一部の科学者は、PCR特許の所有者であるヨーロッパの工業用医薬品大手ホフマン・ラローシュ社が消耗品の価格に不当に高額な使用料を上乗せしていることに激怒した。

もう 1970 つの「推進原理」は、DNA 配列決定法そのものでした。 この方法の化学的基礎は当時、もはや新しいものではありませんでした。州間ヒトゲノム計画 (HGP) は、フレッド サンガーが XNUMX 年代半ばに開発したのと同じ独創的な方法を採用しました。 イノベーションは、シーケンスによって達成できる自動化の規模と程度にありました。

自動シーケンスはもともとカリフォルニア工科大学の Lee Hood の研究室で開発されました。 彼はモンタナ州の高校に通い、クォーターバックとして大学フットボールでプレーしました。 フッドのおかげで、チームは州選手権で複数回優勝しました。 彼のチームワークのスキルは、科学者のキャリアにも役立ちました。 フッドの研究室には化学者、生物学者、エンジニアからなる多彩なスタッフが配置され、すぐに彼の研究室は技術革新のリーダーとなりました。

実際、自動配列決定法は Lloyd Smith と Mike Hunkapiller によって発明されました。 当時フッドの研究室で働いていたマイク・ハンカピラーはロイド・スミスに、塩基の種類ごとに異なる色を付ける改良された配列決定法の提案を持ちかけた。 このようなアイデアにより、サンガープロセスの効率が XNUMX 倍になる可能性があります。 サンガーでは、XNUMX つのチューブのそれぞれで (塩基の数に応じて) 配列を決定するときに、DNA ポリメラーゼの関与により、プライマー配列を含む、異なる長さのオリゴヌクレオチドの固有のセットが形成されます。 次に、鎖分離用のチューブにホルムアミドを加え、XNUMX レーンでポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いました。 Smith と Hunkapiller のバージョンでは、ジデオキシヌクレオチドが XNUMX つの異なる色素で標識され、PCR が XNUMX つのチューブで実行されます。 次に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動中に、ゲル上の特定の位置にレーザー光線が照射されて色素の活性が励起され、検出器はどのヌクレオチドが現在ゲル内を移動しているかを判断します。 当初、スミス氏は悲観的でした。超低用量の色素を使用すると、ヌクレオチド領域が区別できなくなるのではないかと心配していました。 しかし、レーザー技術について優れた理解を持っていた彼は、レーザー光にさらされると蛍光を発する特殊な蛍光色素を使用することで、状況を打開する方法をすぐに見つけました。

（完全版 クリックで - 4,08 MB) 細字: 自動シーケンサーを使用して配列決定された DNA 配列。自動配列決定機から取得されます。 各色は XNUMX つの塩基のいずれかに対応します

サンガー法の古典的なバージョンでは、分析された DNA 鎖の 124 つが酵素 DNA ポリメラーゼによる相補鎖合成の鋳型として機能し、その後 DNA 断片の配列がサイズごとにゲル内で分類されます。 合成中に DNA に含まれ、その後の反応生成物の視覚化を可能にする各フラグメントは、末端塩基に対応する蛍光色素で標識されます (これについては p.XNUMX で説明しました)。 したがって、このフラグメントの蛍光は、特定の塩基の識別子となります。 あとは検出を実行し、反応生成物を可視化するだけです。 結果はコンピューターで分析され、XNUMX つのヌクレオチドに対応する一連のマルチカラーのピークとして表示されます。 その後、情報はコンピュータの情報システムに直接転送されるため、順序付けを非常に困難にする時間のかかる、場合によっては苦痛を伴うデータ入力プロセスが不要になります。

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出所： habr.com