Pamenang Nobel Kimia AmΓ©rika Kary Mullis tilar donya ing California nalika umur 74 taun. Miturut garwane, pati ana ing 7 Agustus. Penyebabe yaiku gagal jantung lan ambegan amarga pneumonia.
James Watson piyambak, penemu molekul DNA, bakal nyritakake babagan kontribusi sing ditindakake kanggo biokimia lan dheweke nampa Bebungah Nobel.
Kutipan saka buku dening James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Sejarah Revolusi Genetik
Bab 7. Genom manungsa. Skenario urip
...
Reaksi rantai polimerase (PCR) diciptakake ing taun 1983 dening ahli biokimia Carey Mullis, sing kerja ing Cetus. Panemon reaksi iki cukup luar biasa. Mullis banjur kelingan: "Ing sawijining dina Jumuah sore ing April 1983, aku ngalami epiphany. Aku ana ing mburi setir, nyopir ing dalan gunung sing padhang rembulan ing California Lor, tanah alas redwood. Iku nyengsemaken sing ing kahanan kuwi inspirasi disabetake wong. Lan iku ora California lor wis dalan khusus sing ningkatakΓ© kaweruh; mung kancane sing tau weruh Mullis ngebut ngebut ing dalan loro sing es lan ora ngganggu dheweke. Kanca ngandhani New York Times: "Mullis duwe visi yen dheweke bakal mati amarga nabrak wit abang. Mula dheweke ora wedi apa-apa nalika nyopir, kajaba ana wit abang sing tuwuh ing pinggir dalan. Anane kayu abang ing sadawane dalan meksa Mullis konsentrasi lan ... iki, wawasan. Mullis nampa Bebungah Nobel Kimia kanggo panemune ing taun 1993 lan wiwit dadi luwih asing ing tumindake. Contone, dheweke minangka pendukung teori revisionis yen AIDS ora ana hubungane karo HIV, sing sacara signifikan ngrusak reputasi dheweke lan ngganggu dokter.
PCR minangka reaksi sing cukup prasaja. Kanggo nindakake iki, kita butuh rong primer sing disintesis kanthi kimia sing nglengkapi ujung-ujung untaian sing beda saka fragmen DNA sing dibutuhake. Primer minangka bagΓ©an cendhak saka DNA untai tunggal, saben dawane kira-kira 20 pasangan basa. Keanehan primer yaiku cocog karo bagean DNA sing kudu digedhekake, yaiku cithakan DNA.
(Gambar bisa diklik) Kary Mullis, penemu PCR
Spesifisitas PCR adhedhasar pambentukan kompleks komplementer ing antarane template lan primer, oligonukleotida sintetik cendhak. Saben primer pelengkap kanggo salah siji untaian saka cithakan double-stranded lan matesi wiwitan lan pungkasan wilayah amplified. Nyatane, asil "matriks" minangka genom kabeh, lan tujuane kanggo ngisolasi fragmen sing menarik kanggo kita. Kanggo nindakake iki, cithakan DNA untai ganda dipanasake nganti 95 Β°C sajrone sawetara menit kanggo misahake untaian DNA. Tahap iki diarani denaturasi amarga ikatan hidrogen ing antarane rong untaian DNA rusak. Sawise untaian wis dipisahake, suhu diturunake kanggo ngidini primer bisa ngiket cithakan siji-stranded. DNA polimerase miwiti replikasi DNA kanthi ngiket rantai nukleotida. Enzim DNA polimerase replikasi untaian cithakan nggunakake primer minangka primer utawa conto kanggo nyalin. Minangka asil saka siklus pisanan, kita entuk kaping pindho urutan saka bagean DNA tartamtu. Sabanjure kita mbaleni prosedur iki. Sawise saben siklus, kita entuk area target kanthi jumlah kaping pindho. Sawise rong puluh lima siklus PCR (yaiku, kurang saka rong jam), kita duwe wilayah DNA sing menarik kanggo kita kanthi jumlah 225 kaping luwih dhuwur tinimbang sing asli (yaiku, kita wis nggedhekake kira-kira 34 yuta kaping). Nyatane, ing input kita nampa campuran primer, DNA template, enzim DNA polimerase lan basa gratis A, C, G lan T, jumlah produk reaksi spesifik (diwatesi dening primer) mundhak kanthi eksponensial, lan jumlah salinan DNA "dawa" iku linear, supaya ing produk reaksi dominasi.
Amplifikasi bagean DNA sing dikarepake: reaksi rantai polimerase
Ing dina awal PCR, masalah utama yaiku ing ngisor iki: sawise saben siklus pemanasan-pendingin, polimerase DNA kudu ditambahake ing campuran reaksi, amarga ora aktif ing suhu 95 ° C. Mulane, perlu kanggo nambah maneh sadurunge saben 25 siklus. Prosedur reaksi kasebut relatif ora efisien, mbutuhake wektu akeh lan enzim polimerase, lan materi kasebut larang banget. Untunge Ibu Alam teka nulungi. Akeh kewan rumangsa nyaman ing suhu sing luwih dhuwur tinimbang 37 °C. Apa sebabe angka 37 °C dadi penting kanggo kita? Iki kedadeyan amarga suhu iki optimal kanggo E. coli, saka ngendi enzim polimerase kanggo PCR wiwitane dijupuk. Ing alam ana mikroorganisme sing protèin, liwat jutaan taun seleksi alam, dadi luwih tahan kanggo suhu dhuwur. Wis diusulake nggunakake polimerase DNA saka bakteri termofilik. Enzim-enzim kasebut dadi termostabil lan bisa tahan akeh siklus reaksi. Panggunaan kasebut ndadekake gampang lan ngotomatisasi PCR. Salah sawijining polimerase DNA termostabil pisanan diisolasi saka bakteri Thermus aquaticus, sing manggon ing sumber panas ing Taman Nasional Yellowstone, lan dijenengi Taq polymerase.
PCR cepet dadi workhorse saka Human Genome Project. UmumΓ©, proses kasebut ora beda karo sing dikembangake dening Mullis, mung wis otomatis. Kita wis ora gumantung maneh ing akeh mahasiswa lulusan surem-witted painstakingly pour tetesan saka Cairan menyang tabung test plastik. Ing laboratorium modern sing nindakake riset genetik molekuler, karya iki ditindakake ing conveyor robot. Robot-robot PCR sing melu proyek sekuensing kaya Genom Manungsa bisa kerja tanpa henti kanthi volume polimerase sing stabil panas. Sawetara ilmuwan sing kerja ing Proyek Genom Manungsa nesu banget amarga royalti sing dhuwur banget sing ditambahake ing biaya bahan bakar dening pemilik paten PCR, raksasa farmasi industri Eropa Hoffmann-LaRoche.
"Prinsip nyopir" liyane yaiku metode urutan DNA dhewe. Basis kimia saka cara iki ora anyar maneh nalika iku: Interstate Human Genome Project (HGP) nggunakake cara sing padha karo Fred Sanger sing dikembangake ing pertengahan 1970-an. Inovasi kasebut ana ing skala lan tingkat otomatisasi sing bisa digayuh kanthi urutan.
Urutan otomatis wiwitane dikembangake ing laboratorium Lee Hood ing Institut Teknologi California. Dheweke sekolah dhuwur ing Montana lan main bal-balan College minangka quarterback a; Thanks kanggo Hood, tim menang juara negara luwih saka sepisan. Katrampilan kerja tim uga migunani ing karir ilmiah. Laboratorium Hood dikelola dening kru kimiawan, ahli biologi, lan insinyur, lan laboratorium kasebut dadi pimpinan inovasi teknologi.
Nyatane, metode urutan otomatis diciptakake dening Lloyd Smith lan Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, banjur makarya ing laboratorium Hood, nyedhaki Lloyd Smith karo proposal kanggo cara urutan apik kang saben jinis basa bakal colored beda. Gagasan kasebut bisa nambah efisiensi proses Sanger. Ing Sanger, nalika urutan ing saben patang tabung (miturut jumlah basa), kanthi partisipasi polimerase DNA, sekumpulan oligonukleotida sing beda-beda dawa dibentuk, kalebu urutan primer. Sabanjure, formamide ditambahake ing tabung kanggo pamisahan rantai lan elektroforesis gel polyacrylamide ditindakake ing papat jalur. Ing versi Smith lan Hunapilller, dideoxynucleotides diwenehi label karo papat pewarna sing beda lan PCR ditindakake ing siji tabung. Banjur, sajrone elektroforesis gel polyacrylamide, sinar laser ing lokasi tartamtu ing gel excites kegiatan pewarna, lan detektor nemtokake nukleotida saiki migrasi liwat gel. Wiwitane, Smith pesimis - dheweke wedi yen nggunakake pewarna dosis ultra-rendah bakal nyebabake wilayah nukleotida ora bisa dibedakake. Nanging, duwe pangerten banget babagan teknologi laser, dheweke banjur nemokake cara metu saka kahanan kasebut kanthi nggunakake pewarna fluorochrome khusus sing fluoresce nalika kena radiasi laser.
(Versi lengkap - 4,08 MB) Fine print: urutan DNA diurutake nggunakake sequencer otomatis, dijupuk saka mesin urutan otomatis. Saben werna cocog karo salah siji saka papat dhasar
Ing versi klasik saka metode Sanger, salah sawijining untaian DNA sing dianalisis minangka cithakan kanggo sintesis untaian komplementer dening enzim DNA polimerase, banjur urutan fragmen DNA diurutake kanthi ukuran gel. Saben fragmen sing kalebu ing DNA sajrone sintesis lan ngidini visualisasi produk reaksi sabanjure diwenehi label pewarna neon sing cocog karo pangkalan terminal (iki wis dibahas ing kaca 124); mulane, fluoresensi pecahan iki bakal dadi pengenal kanggo basis tartamtu. Banjur sing isih ana yaiku nindakake deteksi lan nggambarake produk reaksi. Asil dianalisis nganggo komputer lan ditampilake minangka urutan puncak multi-warna sing cocog karo papat nukleotida. Informasi kasebut banjur ditransfer langsung menyang sistem informasi komputer, ngilangi proses entri data sing mbutuhake wektu lan kadhangkala nglarani sing nggawe urutane angel banget.
Β» Rincian liyane babagan buku bisa ditemokake ing
Β»
Β»
Kanggo Khabrozhiteley diskon 25% nggunakake kupon - PCR
Source: www.habr.com