ნობელის პრემიის ლაურეატი კარი მალისი, დნმ პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის გამომგონებელი გარდაიცვალა

ამერიკელი ნობელის პრემიის ლაურეატი ქიმიის დარგში კარი მალისი კალიფორნიაში 74 წლის ასაკში გარდაიცვალა. მისი მეუღლის თქმით, გარდაცვალება 7 აგვისტოს მოხდა. მიზეზი არის პნევმონიით გამოწვეული გულის და სუნთქვის უკმარისობა.

თავად ჯეიმს უოტსონი, დნმ-ის მოლეკულის აღმომჩენი, მოგვითხრობს იმ წვლილის შესახებ, რომელიც მან ბიოქიმიაში შეიტანა და რისთვისაც მიიღო ნობელის პრემია.

ნაწყვეტი ჯეიმს უოტსონის, ენდრიუ ბერის, კევინ დევისის წიგნიდან

დნმ. გენეტიკური რევოლუციის ისტორია

თავი 7. ადამიანის გენომი. ცხოვრებისეული სცენარი

...
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) გამოიგონა 1983 წელს ბიოქიმიკოს კერი მალისის მიერ, რომელიც მუშაობდა Cetus-ში. ამ რეაქციის აღმოჩენა საკმაოდ გასაოცარი იყო. მალისი მოგვიანებით იხსენებდა: „1983 წლის აპრილის ერთ პარასკევს საღამოს მე მქონდა ნათლისღება. მე ვიჯექი საჭესთან, მთვარით განათებულ, მიხვეულ-მოხვეულ მთის გზაზე ჩრდილოეთ კალიფორნიაში, წითური ტყეების ქვეყანაში“. შთამბეჭდავია, რომ სწორედ ასეთ სიტუაციაში მოხვდა მას შთაგონება. და ეს არ არის ის, რომ ჩრდილოეთ კალიფორნიას აქვს სპეციალური გზები, რომლებიც ხელს უწყობენ გამჭრიახობას; უბრალოდ, მისმა მეგობარმა ერთხელ დაინახა მალისი, რომელიც დაუფიქრებლად მიდიოდა ყინულოვანი ორმაგი სავალი ნაწილის გასწვრივ და ეს მას საერთოდ არ აწუხებდა. მეგობარმა განუცხადა New York Times-ს: „მალისს ჰქონდა ხილვა, რომ ის მოკვდებოდა წითელ ხეზე შეჯახებით. ამიტომ, მანქანის მართვისას არაფრის არ ეშინია, თუ გზაზე წითური ხეები არ არის ამოსული“. გზის გასწვრივ წითელი ხეების არსებობამ აიძულა მალისი კონცენტრირება მოეხდინა და... აი, ეს იყო გამჭრიახობა. მალისმა მიიღო ნობელის პრემია ქიმიაში თავისი გამოგონებისთვის 1993 წელს და მას შემდეგ კიდევ უფრო უცნაური გახდა თავის ქმედებებში. მაგალითად, ის არის რევიზიონისტული თეორიის მხარდამჭერი, რომ შიდსი არ არის დაკავშირებული აივ-თან, რამაც საგრძნობლად შეარყია საკუთარი რეპუტაცია და ერეოდა ექიმებში.

PCR საკმაოდ მარტივი რეაქციაა. მის განსახორციელებლად, ჩვენ გვჭირდება ორი ქიმიურად სინთეზირებული პრაიმერი, რომლებიც ავსებენ საჭირო დნმ-ის ფრაგმენტის სხვადასხვა ჯაჭვების საპირისპირო ბოლოებს. პრაიმერები არის ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოკლე მონაკვეთები, თითოეული სიგრძით დაახლოებით 20 ბაზის წყვილი. პრაიმერების თავისებურება ის არის, რომ ისინი შეესაბამება დნმ-ის სექციებს, რომლებიც საჭიროებს გაძლიერებას, ანუ დნმ-ის შაბლონს.

(სურათის დაწკაპუნება) კარი მალისი, PCR-ის გამომგონებელი

PCR-ის სპეციფიკა ემყარება თარგსა და პრაიმერებს, მოკლე სინთეზურ ოლიგონუკლეოტიდებს შორის დამატებითი კომპლექსების წარმოქმნას. თითოეული პრაიმერი ავსებს ორჯაჭვიანი შაბლონის ერთ-ერთ ძაფს და ზღუდავს გაძლიერებული რეგიონის დასაწყისსა და დასასრულს. სინამდვილეში, მიღებული „მატრიცა“ არის მთელი გენომი და ჩვენი მიზანია მისგან გამოვყოთ ჩვენთვის საინტერესო ფრაგმენტები. ამისათვის ორჯაჭვიანი დნმ-ის შაბლონი თბება 95 °C-მდე რამდენიმე წუთის განმავლობაში დნმ-ის ჯაჭვების გამოსაყოფად. ამ სტადიას დენატურაცია ეწოდება, რადგან დნმ-ის ორ ჯაჭვს შორის წყალბადის ბმები გატეხილია. მას შემდეგ, რაც ძაფები გაიყოფა, ტემპერატურა იკლებს, რათა პრაიმერები მიბმული იყვნენ ერთჯაჭვიან შაბლონთან. დნმ პოლიმერაზა იწყებს დნმ-ის რეპლიკაციას ნუკლეოტიდური ჯაჭვის მონაკვეთთან შეკავშირებით. ფერმენტი დნმ პოლიმერაზა იმეორებს შაბლონის ძაფს პრაიმერის, როგორც პრაიმერის ან კოპირების მაგალითის გამოყენებით. პირველი ციკლის შედეგად ვიღებთ დნმ-ის გარკვეული მონაკვეთის მრავალჯერადი თანმიმდევრული გაორმაგებას. შემდეგ ჩვენ ვიმეორებთ ამ პროცედურას. ყოველი ციკლის შემდეგ ვიღებთ სამიზნე ფართობს ორმაგი რაოდენობით. ოცდახუთი PCR ციკლის შემდეგ (ანუ ორ საათზე ნაკლებ დროში), ჩვენ გვაქვს ჩვენთვის საინტერესო დნმ-ის რეგიონი ორიგინალზე 225-ჯერ მეტი რაოდენობით (ანუ ჩვენ გავაძლიერეთ ის დაახლოებით 34 მილიონჯერ). ფაქტობრივად, შეყვანისას მივიღეთ პრაიმერების, შაბლონის დნმ-ის, დნმ პოლიმერაზას ფერმენტის და თავისუფალი ფუძეების A, C, G და T ნარევი, კონკრეტული რეაქციის პროდუქტის რაოდენობა (პრაიმერებით შეზღუდული) ექსპონენტურად იზრდება და რიცხვი. დნმ-ის „გრძელი“ ასლები წრფივია, ამიტომ რეაქციის პროდუქტები დომინირებს.

სასურველი დნმ-ის მონაკვეთის გაძლიერება: პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია

PCR-ის ადრეულ დღეებში მთავარი პრობლემა შემდეგი იყო: ყოველი გათბობა-გაგრილების ციკლის შემდეგ, დნმ პოლიმერაზას უნდა დაემატებინა სარეაქციო ნარევში, რადგან ის ინაქტივირებული იყო 95°C ტემპერატურაზე. ამიტომ საჭირო იყო მისი ხელახლა დამატება ყოველი 25 ციკლის წინ. რეაქციის პროცედურა შედარებით არაეფექტური იყო, საჭიროებდა დიდ დროს და პოლიმერაზას ფერმენტს, მასალა კი ძალიან ძვირი. საბედნიეროდ, დედა ბუნება მოვიდა სამაშველოში. ბევრი ცხოველი თავს კომფორტულად გრძნობს 37 °C-ზე ბევრად მაღალ ტემპერატურაზე. რატომ გახდა ჩვენთვის მნიშვნელოვანი ფიგურა 37 °C? ეს იმიტომ მოხდა, რომ ეს ტემპერატურა ოპტიმალურია E. coli-სთვის, საიდანაც თავდაპირველად მიიღეს PCR-სთვის პოლიმერაზას ფერმენტი. ბუნებაში არსებობს მიკროორგანიზმები, რომელთა ცილები, ბუნებრივი გადარჩევის მილიონობით წლის განმავლობაში, უფრო მდგრადი გახდა მაღალი ტემპერატურის მიმართ. შემოთავაზებულია თერმოფილური ბაქტერიების დნმ პოლიმერაზების გამოყენება. ეს ფერმენტები აღმოჩნდა თერმოსტაბილური და შეძლეს გაუძლოს მრავალი რეაქციის ციკლს. მათმა გამოყენებამ შესაძლებელი გახადა PCR-ის გამარტივება და ავტომატიზაცია. ერთ-ერთი პირველი თერმომდგრადი დნმ პოლიმერაზა იზოლირებული იქნა ბაქტერიისგან Thermus aquaticus, რომელიც ცხოვრობს Yellowstone National Park-ის ცხელ წყაროებში და ეწოდა Taq polymerase.

PCR სწრაფად გახდა ადამიანის გენომის პროექტის სამუშაო ადგილი. ზოგადად, პროცესი არაფრით განსხვავდება Mullis-ის მიერ შემუშავებული პროცესისგან, ის ახლახან ავტომატიზირებულია. ჩვენ უკვე აღარ ვიყავით დამოკიდებული ბრბოზე დაბნელებული კურსდამთავრებულების ბრბოზე, რომლებიც მტკივნეულად ასხამდნენ სითხის წვეთებს პლასტმასის საცდელ მილებში. თანამედროვე ლაბორატორიებში, რომლებიც ახორციელებენ მოლეკულურ გენეტიკურ კვლევას, ეს სამუშაო შესრულებულია რობოტ კონვეიერებზე. PCR რობოტები, რომლებიც მონაწილეობენ ადამიანის გენომის მსგავსი თანმიმდევრობის პროექტში, დაუღალავად მუშაობენ სითბოსადმი მდგრადი პოლიმერაზის უზარმაზარი მოცულობებით. ადამიანის გენომის პროექტზე მომუშავე ზოგიერთი მეცნიერი აღშფოთებული იყო PCR პატენტის მფლობელის, ევროპული ინდუსტრიული ფარმაცევტული გიგანტის Hoffmann-LaRoche-ის მიერ სახარჯო მასალის ღირებულების უსაფუძვლოდ მაღალმა ჰონორარმა.

კიდევ ერთი „მამოძრავებელი პრინციპი“ იყო თავად დნმ-ის თანმიმდევრობის მეთოდი. ამ მეთოდის ქიმიური საფუძველი იმ დროს ახალი აღარ იყო: ადამიანის გენომის სახელმწიფოთაშორისმა პროექტმა (HGP) მიიღო იგივე გენიალური მეთოდი, რომელიც ფრედ სანგერმა ჯერ კიდევ 1970-იანი წლების შუა ხანებში შეიმუშავა. ინოვაცია მდგომარეობდა ავტომატიზაციის მასშტაბსა და ხარისხში, რომლის მიღწევაც მიმდევრობამ შეძლო.

ავტომატური თანმიმდევრობა თავდაპირველად შეიქმნა ლი ჰუდის ლაბორატორიაში კალიფორნიის ტექნოლოგიის ინსტიტუტში. ის სწავლობდა მონტანას საშუალო სკოლაში და თამაშობდა კოლეჯის ფეხბურთს მეოთხედმცველად; ჰუდის წყალობით გუნდმა არაერთხელ მოიგო სახელმწიფო ჩემპიონატი. მისი გუნდური მუშაობის უნარები ასევე გამოგადგებათ მის სამეცნიერო კარიერაში. ჰუდის ლაბორატორია დაკომპლექტებული იყო ქიმიკოსების, ბიოლოგების და ინჟინრების ჭრელი ეკიპაჟით და მისი ლაბორატორია მალე გახდა ლიდერი ტექნოლოგიური ინოვაციების სფეროში.

სინამდვილეში, ავტომატური თანმიმდევრობის მეთოდი გამოიგონეს ლოიდ სმიტმა და მაიკ ჰუნკაპილერმა. მაიკ ჰუნკაპილერი, რომელიც მაშინ მუშაობდა ჰუდის ლაბორატორიაში, მიმართა ლოიდ სმიტს წინადადებით გაუმჯობესებული თანმიმდევრობის მეთოდის შესახებ, რომლის დროსაც თითოეული ტიპის ფუძე განსხვავებულად იქნებოდა შეღებილი. ასეთმა იდეამ შეიძლება გააოთხმაგოს სანგერის პროცესის ეფექტურობა. სანჯერში, ოთხივე მილში (ბაზების რაოდენობის მიხედვით) თანმიმდევრობის დადგენისას, დნმ პოლიმერაზას მონაწილეობით, წარმოიქმნება სხვადასხვა სიგრძის ოლიგონუკლეოტიდების უნიკალური ნაკრები, მათ შორის პრაიმერის თანმიმდევრობა. შემდეგი, ფორმამიდი დაემატა მილებს ჯაჭვის გამოყოფისთვის და პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზი ჩატარდა ოთხ ზოლზე. სმიტის და ჰუნკაპილერის ვერსიაში, დიდოქსინუკლეოტიდებს ეტიკეტებენ ოთხი განსხვავებული საღებავით და PCR კეთდება ერთ მილში. შემდეგ, პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზის დროს, ლაზერის სხივი გელის კონკრეტულ ადგილას აღაგზნებს საღებავების აქტივობას და დეტექტორი განსაზღვრავს რომელი ნუკლეოტიდი მიგრირებს ამჟამად გელის მეშვეობით. თავდაპირველად სმიტი პესიმისტური იყო - მას ეშინოდა, რომ საღებავის ულტრა დაბალი დოზების გამოყენებამ გამოიწვევდა ნუკლეოტიდური უბნების გარჩევას. თუმცა, ლაზერული ტექნოლოგიის შესანიშნავად ერკვეოდა, მან მალევე იპოვა გამოსავალი სიტუაციიდან სპეციალური ფტოროქრომული საღებავების გამოყენებით, რომლებიც ფლუორესცირებენ ლაზერული გამოსხივების ზემოქმედებისას.

(Სრული ვერსია დაწკაპუნებით - 4,08 მბ) წვრილმანი ბეჭდვითი: დნმ-ის თანმიმდევრობა ავტომატური სეკვენსერის გამოყენებით, მიღებული ავტომატური სეკვენსირების აპარატიდან. თითოეული ფერი შეესაბამება ოთხიდან ერთს

Sanger-ის მეთოდის კლასიკურ ვერსიაში, გაანალიზებული დნმ-ის ერთ-ერთი ჯაჭვი მოქმედებს როგორც თარგი დამატებითი ჯაჭვის სინთეზისთვის ფერმენტ დნმ პოლიმერაზას მიერ, შემდეგ დნმ-ის ფრაგმენტების თანმიმდევრობა დალაგებულია გელში ზომის მიხედვით. თითოეული ფრაგმენტი, რომელიც შედის დნმ-ში სინთეზის დროს და იძლევა რეაქციის პროდუქტების შემდგომ ვიზუალიზაციას, ეტიკეტირებულია ფლუორესცენტური საღებავით, რომელიც შეესაბამება ტერმინალურ ფუძეს (ეს განხილული იყო გვ. 124); შესაბამისად, ამ ფრაგმენტის ფლუორესცენცია იქნება მოცემული ბაზის იდენტიფიკატორი. შემდეგ რჩება მხოლოდ გამოვლენა და რეაქციის პროდუქტების ვიზუალიზაცია. შედეგები გაანალიზებულია კომპიუტერით და წარმოდგენილია მრავალ ფერადი მწვერვალების თანმიმდევრობით, რომლებიც შეესაბამება ოთხ ნუკლეოტიდს. ამის შემდეგ ინფორმაცია პირდაპირ გადაეცემა კომპიუტერის საინფორმაციო სისტემას, რაც გამორიცხავს მონაცემთა შეყვანის დროს შრომატევად და ზოგჯერ მტკივნეულ პროცესს, რაც ძალიან ართულებდა თანმიმდევრობას.

» მეტი ინფორმაცია წიგნის შესახებ შეგიძლიათ იხილოთ აქ გამომცემლის ვებსაიტზე
» სარჩევი
» ნაწყვეტი

Khabrozhiteley-ზე 25% ფასდაკლება კუპონის გამოყენებით - PCR

წყარო: www.habr.com