Америкалық химия бойынша Нобель сыйлығының лауреаты Кэри Маллис Калифорнияда 74 жасында қайтыс болды. Әйелінің айтуынша, өлім 7 тамызда болған. Оның себебі - пневмонияға байланысты жүрек және тыныс алу жеткіліксіздігі.
ДНҚ молекуласын ашқан Джеймс Уотсонның өзі биохимияға қосқан үлесі және ол үшін Нобель сыйлығын алғаны туралы айтып береді.
Джеймс Уотсон, Эндрю Берри, Кевин Дэвис кітабынан үзінді
ДНҚ. Генетикалық революцияның тарихы
7-тарау. Адам геномы. Өмірлік сценарий
...
Полимеразды тізбекті реакцияны (ПТР) 1983 жылы Цетуста жұмыс істеген биохимик Кэри Муллис ойлап тапты. Бұл реакцияның ашылуы өте керемет болды. Муллис кейінірек былай деп есіне алды: «1983 жылдың сәуір айының бір жұма күні кешке менде бір сезім болды. Мен рульде болдым, солтүстік Калифорнияда, қызыл ормандар жерінде, ай сәулесі, бұралған тау жолмен келе жатырмын ». Шабыттың өзіне осындай жағдайда түскені әсерлі. Калифорнияның солтүстігінде түсінуге ықпал ететін арнайы жолдар бар емес; Бірде оның досы Муллистің мұзды қос жүріс бөлігінде абайсызда жылдамдықпен келе жатқанын көрді және бұл оны мүлдем мазаламады. Бір досы New York Times газетіне: «Муллис қызыл ағашқа соғылып өлетінін көрді. Сондықтан жол бойында қызыл ағаштар өспесе, көлік жүргізіп келе жатқанда ештеңеден қорықпайды». Жол бойында қызыл ағаштардың болуы Муллисті зейінін шоғырландыруға мәжбүр етті және... міне, түсінікті болды. Муллис 1993 жылы өнертабысы үшін химия бойынша Нобель сыйлығын алды және содан бері оның әрекеттері одан да бейтаныс болды. Мысалы, ол ЖҚТБ-ның АИТВ-мен байланысы жоқ деген ревизионистік теорияны жақтайды, бұл оның өзінің беделіне айтарлықтай нұқсан келтіріп, дәрігерлерге кедергі келтірді.
ПТР - бұл өте қарапайым реакция. Оны жүзеге асыру үшін бізге қажетті ДНҚ фрагментінің әртүрлі жіптерінің қарама-қарсы ұштарын толықтыратын екі химиялық синтезделген праймер қажет. Праймерлер - әрқайсысының ұзындығы шамамен 20 негіз жұбы болатын бір тізбекті ДНҚ-ның қысқа бөліктері. Праймерлердің ерекшелігі олар күшейтуді қажет ететін ДНҚ бөлімдеріне, яғни ДНҚ шаблонына сәйкес келеді.
(Кескінді басуға болады) Кари Муллис, ПТР өнертапқышы
ПТР ерекшелігі шаблон мен праймерлер, қысқа синтетикалық олигонуклеотидтер арасында комплементарлы кешендердің түзілуіне негізделген. Әрбір праймер қос тізбекті шаблонның бір жолына қосымша болып табылады және күшейтілген аймақтың басы мен соңын шектейді. Шын мәнінде, алынған «матрица» тұтас геном болып табылады және біздің мақсатымыз одан бізді қызықтыратын фрагменттерді оқшаулау болып табылады. Ол үшін қос тізбекті ДНҚ шаблонын ДНҚ тізбектерін бөлу үшін бірнеше минут бойы 95 °C дейін қыздырады. Бұл кезең денатурация деп аталады, өйткені екі ДНҚ тізбегі арасындағы сутектік байланыс үзіледі. Жіптер бөлінгеннен кейін, праймерлердің бір тізбекті шаблонмен байланысуына мүмкіндік беру үшін температура төмендетіледі. ДНҚ полимераза нуклеотидтер тізбегінің созылуымен байланысу арқылы ДНҚ репликациясын бастайды. ДНҚ-полимераза ферменті көшіру үшін праймер немесе мысал ретінде праймерді пайдаланып шаблон тізбегін репликациялайды. Бірінші циклдің нәтижесінде белгілі бір ДНҚ бөлімінің бірнеше ретті екі еселенуін аламыз. Әрі қарай осы процедураны қайталаймыз. Әрбір циклден кейін біз екі еселенген мөлшерде мақсатты аумақты аламыз. Жиырма бес ПТР циклінен кейін (яғни, екі сағаттан аз уақыт ішінде) бізде бастапқыдан 225 есе жоғары (яғни, біз оны шамамен 34 миллион есе күшейттік) бізді қызықтыратын ДНҚ аймағы бар. Шындығында, кірісте біз праймерлердің қоспасын, ДНҚ шаблонын, ДНҚ-полимераза ферментін және бос A, C, G және T негіздерін алдық, белгілі бір реакция өнімінің мөлшері (праймерлермен шектелген) экспоненциалды түрде өседі және саны «ұзын» ДНҚ көшірмелері сызықты, сондықтан реакцияда өнімдер басым болады.
Қажетті ДНҚ бөлімін күшейту: полимеразды тізбекті реакция
ПТР-дың алғашқы күндерінде негізгі мәселе келесі болды: әрбір қыздыру-салқындату циклінен кейін реакция қоспасына ДНҚ-полимеразаны қосу керек болды, өйткені ол 95 ° C температурада белсендірілмеген. Сондықтан оны 25 циклдің әрқайсысының алдында қайта қосу қажет болды. Реакция процедурасы салыстырмалы түрде тиімсіз болды, көп уақыт пен полимеразды ферментті қажет етті және материал өте қымбат болды. Бақытымызға орай, Табиғат-Ана көмекке келді. Көптеген жануарлар 37 ° C-тан жоғары температурада өздерін жайлы сезінеді. Неліктен 37 °C көрсеткіші біз үшін маңызды болды? Бұл температура бастапқыда ПТР үшін полимераз ферменті алынған E. coli үшін оңтайлы болғандықтан болды. Табиғатта белоктары миллиондаған жылдар бойы табиғи сұрыпталу нәтижесінде жоғары температураға төзімдірек болған микроорганизмдер бар. Термофильді бактериялардың ДНҚ полимеразаларын қолдану ұсынылды. Бұл ферменттер термотұрақты болып шықты және көптеген реакция циклдарына төтеп бере алды. Оларды қолдану ПТР-ны жеңілдетуге және автоматтандыруға мүмкіндік берді. Алғашқы термотұрақты ДНҚ-полимеразалардың бірі Йеллоустоун ұлттық паркінің ыстық көздерінде мекендейтін Thermus aquaticus бактериясынан бөлініп алынды және ол Taq полимераза деп аталды.
ПТР тез арада адам геномы жобасының жұмыс күші болды. Жалпы, процесс Муллис әзірлегеннен еш айырмашылығы жоқ, ол жаңа ғана автоматтандырылған. Біз бұдан былай пластикалық пробиркаларға сұйықтық тамшыларын құйып жатқан аспиранттар тобына тәуелді болдық. Молекулярлық-генетикалық зерттеулер жүргізетін заманауи зертханаларда бұл жұмыс роботты конвейерлерде орындалады. Адам геномы сияқты үлкен секвенирлеу жобасына қатысатын ПТР роботтары ыстыққа төзімді полимеразаның үлкен көлемімен тынымсыз жұмыс істейді. Адам геномы жобасында жұмыс істейтін кейбір ғалымдар ПТР патентінің иесі, еуропалық өнеркәсіптік фармацевтикалық алпауыт Хоффман-ЛаРоштың шығын материалдарының құнына қосқан негізсіз жоғары роялтиіне ашуланды.
Тағы бір «қозғаушы принцип» ДНҚ секвенирлеу әдісінің өзі болды. Бұл әдістің химиялық негізі сол кезде жаңалық емес еді: Мемлекетаралық адам геномы жобасы (HGP) Фред Сэнгер 1970 жылдардың ортасында әзірлеген тапқыр әдісті қабылдады. Инновация автоматтандырудың масштабы мен дәрежесінде болды, бұл реттілік қол жеткізе алды.
Автоматтандырылған секвенирлеу бастапқыда Калифорния технологиялық институтындағы Ли Гуд зертханасында жасалған. Ол Монтанадағы орта мектепте оқыды және колледж футболын қорғаушы ретінде ойнады; Гудтың арқасында команда бірнеше рет штат чемпионатында жеңіске жетті. Оның топта жұмыс істеу дағдысы оның ғылыми қызметінде де пайдалы болды. Гудтың зертханасында химиктер, биологтар және инженерлерден тұратын түрлі-түсті бригада жұмыс істеді және оның зертханасы көп ұзамай технологиялық инновациялардың көшбасшысы болды.
Шын мәнінде, автоматтандырылған секвенирлеу әдісін Ллойд Смит пен Майк Хункапиллер ойлап тапты. Содан кейін Гуд зертханасында жұмыс істейтін Майк Хункапиллер Ллойд Смитке негіздің әр түрі әртүрлі боялатын жақсартылған секвенирлеу әдісі туралы ұсыныспен жүгінді. Мұндай идея Сэнгер процесінің тиімділігін төрт есе арттыруы мүмкін. Сэнгерде төрт түтіктің әрқайсысында (негіздердің санына сәйкес) секвенирлеу кезінде ДНҚ-полимеразаның қатысуымен әртүрлі ұзындықтағы олигонуклеотидтердің бірегей жиынтығы, оның ішінде праймер тізбегі түзіледі. Содан кейін тізбекті бөлу үшін түтіктерге формамид қосылды және төрт жолақта полиакриламидті гель электрофорезі орындалды. Смит пен Хункапиллердің нұсқасында дидеоксинуклеотидтер төрт түрлі бояғыштармен таңбаланады және ПТР бір түтікте орындалады. Содан кейін, полиакриламидті гель электрофорезі кезінде гельдің белгілі бір жеріндегі лазер сәулесі бояғыштардың белсенділігін қоздырады және детектор қазіргі уақытта гель арқылы қандай нуклеотидтің көшіп жатқанын анықтайды. Алғашында Смит пессимистік болды - ол бояғыштың өте төмен дозаларын қолдану нуклеотидті аймақтардың бір-бірінен ажыратылмайтындығына әкеледі деп қорықты. Дегенмен, лазерлік технологияны жақсы түсінген ол көп ұзамай лазер сәулесінің әсерінен флуоресцентті болатын арнайы фторхромды бояуларды қолдану арқылы жағдайдан шығудың жолын тапты.
(Толық нұсқа - 4,08 МБ) Нәзік басып шығару: автоматты секвенирлеу машинасынан алынған, автоматты секвенсер арқылы реттелген ДНҚ тізбегі. Әрбір түс төрт негіздің біріне сәйкес келеді
Сэнгер әдісінің классикалық нұсқасында талданатын ДНҚ тізбегінің бірі ДНҚ-полимераза ферменті арқылы комплементарлы тізбекті синтездеу үшін шаблон ретінде әрекет етеді, содан кейін ДНҚ фрагменттерінің тізбегі гельде өлшемі бойынша сұрыпталады. Синтез кезінде ДНҚ құрамына кіретін және реакция өнімдерін кейіннен визуализациялауға мүмкіндік беретін әрбір фрагмент терминалдық негізге сәйкес келетін флуоресцентті бояумен таңбаланады (бұл туралы 124-бетте талқыланды); сондықтан бұл фрагменттің флуоресценциясы берілген негіз үшін идентификатор болады. Содан кейін реакция өнімдерін анықтау және визуализациялау ғана қалады. Нәтижелер компьютерде талданады және төрт нуклеотидке сәйкес келетін көп түсті шыңдардың тізбегі ретінде ұсынылады. Содан кейін ақпарат компьютердің ақпараттық жүйесіне тікелей тасымалданады, бұл реттілікті өте қиындататын уақытты қажет ететін және кейде азапты деректерді енгізу процесін жояды.
» Кітап туралы толық ақпаратты мына жерден табуға болады
»
»
Khabrozhiteley үшін купонды пайдалану арқылы 25% жеңілдік - ПТР
Ақпарат көзі: www.habr.com