DNA 중합효소 연쇄반응의 창시자인 노벨상 수상자 캐리 멀리스(Kary Mullis)가 사망했습니다.

미국의 노벨 화학상 수상자 캐리 멀리스(Kary Mullis)가 캘리포니아에서 74세의 나이로 사망했습니다. 그의 아내에 따르면 지난 7월 XNUMX일 사망했다고 한다. 원인은 폐렴으로 인한 심부전과 호흡부전이다.

DNA 분자의 발견자인 제임스 왓슨 자신이 생화학에 대한 그의 공헌과 그가 노벨상을 받은 것에 대해 이야기할 것입니다.

James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis의 책에서 발췌

DNA. 유전 혁명의 역사

7장. 인간 게놈. 생활 시나리오

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중합효소연쇄반응(PCR)은 1983년 Cetus에서 일했던 생화학자 Carey Mullis에 의해 발명되었습니다. 이 반응의 발견은 매우 놀랍습니다. 멀리스는 나중에 이렇게 회상했습니다. “1983년 1993월 어느 금요일 저녁, 나는 깨달음을 얻었습니다. 나는 운전석에 앉아 삼나무 숲의 땅인 캘리포니아 북부의 달빛이 비치는 구불구불한 산길을 운전하고 있었습니다.” 그런 상황에서 영감이 떠올랐다는 점이 인상적이다. 그리고 북부 캘리포니아에 통찰력을 높이는 특별한 길이 있는 것은 아닙니다. 단지 그의 친구가 멀리스가 얼어붙은 이중 차도를 따라 무모하게 속도를 내는 것을 본 적이 있을 뿐이고 그것은 전혀 그를 괴롭히지 않았습니다. 한 친구는 New York Times에 다음과 같이 말했습니다. “Mullis는 자신이 삼나무에 부딪혀 죽게 될 것이라는 비전을 가지고 있었습니다. 그러므로 그는 길을 따라 자라는 삼나무가 없다면 운전하는 동안 아무것도 두려워하지 않습니다.” 길을 따라 있는 삼나무의 존재로 인해 Mullis는 집중하게 되었고... 여기에 통찰력이 있었습니다. 멀리스는 XNUMX년에 자신의 발명으로 노벨 화학상을 받았으며 그 이후로 그의 행동은 더욱 이상해졌습니다. 예를 들어, 그는 AIDS가 HIV와 관련이 없다는 수정주의 이론의 지지자이며, 이는 자신의 평판을 크게 훼손하고 의사를 방해했습니다.

PCR은 매우 간단한 반응입니다. 이를 수행하려면 필요한 DNA 단편의 서로 다른 가닥의 반대쪽 말단에 상보적인 두 개의 화학적으로 합성된 프라이머가 필요합니다. 프라이머는 단일 가닥 DNA의 짧은 부분으로, 각 길이는 약 20개 염기쌍입니다. 프라이머의 특징은 증폭이 필요한 DNA 섹션, 즉 DNA 템플릿에 해당한다는 것입니다.

(이미지 클릭 가능) PCR의 창시자인 Kary Mullis

PCR의 특이성은 주형과 짧은 합성 올리고뉴클레오티드인 프라이머 사이의 상보적 복합체의 형성에 기초합니다. 각 프라이머는 이중 가닥 주형의 가닥 중 하나에 상보적이며 증폭된 영역의 시작과 끝을 제한합니다. 실제로 결과로 생성되는 "매트릭스"는 전체 게놈이며, 우리의 목표는 여기에서 관심 있는 단편을 분리하는 것입니다. 이를 위해 이중 가닥 DNA 주형을 몇 분 동안 95°C로 가열하여 DNA 가닥을 분리합니다. 두 DNA 가닥 사이의 수소 결합이 끊어지기 때문에 이 단계를 변성이라고 합니다. 가닥이 분리되면 프라이머가 단일 가닥 주형에 결합할 수 있도록 온도가 낮아집니다. DNA 중합효소는 일련의 뉴클레오티드 사슬에 결합하여 DNA 복제를 시작합니다. 효소 DNA 중합효소는 프라이머를 복사용 프라이머 또는 예로 사용하여 주형 가닥을 복제합니다. 첫 번째 사이클의 결과로 특정 DNA 섹션의 다중 순차적 배가를 얻습니다. 다음으로 이 절차를 반복합니다. 각 사이클 후에 우리는 목표 영역을 두 배로 얻습니다. 225번의 PCR 주기(즉, 34시간 미만) 후에 우리는 원본보다 XNUMX배 더 많은 양의 관심 있는 DNA 영역을 갖게 됩니다(즉, 약 XNUMX만 배 증폭했습니다). 실제로 입력에서 우리는 프라이머, 주형 DNA, DNA 폴리머라제 효소 및 유리 염기 A, C, G 및 T의 혼합물을 받았고 특정 반응 생성물(프라이머에 의해 제한됨)의 양은 기하급수적으로 증가하며 " 긴” DNA 사본은 선형이므로 반응 생성물이 지배적입니다.

원하는 DNA 부분의 증폭: 중합효소연쇄반응

PCR 초기의 주요 문제점은 다음과 같았다: 각 가열-냉각 주기 후에 DNA 중합효소가 95℃의 온도에서 비활성화되기 때문에 반응 혼합물에 첨가해야 했다. 따라서 25사이클마다 다시 추가해야 했습니다. 반응과정은 상대적으로 비효율적이었고 많은 시간과 중합효소가 필요했고 재료도 매우 비쌌다. 운 좋게도 대자연이 구출해 주었습니다. 많은 동물들은 37°C보다 훨씬 높은 온도에서 편안함을 느낍니다. 37°C라는 숫자가 왜 우리에게 중요해졌나요? 이는 PCR용 중합효소를 원래 얻었던 대장균에 이 온도가 최적이기 때문이다. 자연에는 수백만 년의 자연 선택을 통해 단백질이 고온에 더 잘 견디게 된 미생물이 있습니다. 호열성 박테리아의 DNA 중합효소를 사용하는 것이 제안되었습니다. 이 효소는 열에 안정하고 많은 반응 주기를 견딜 수 있는 것으로 나타났습니다. 이를 사용하면 PCR을 단순화하고 자동화할 수 있습니다. 최초의 열안정성 DNA 중합효소 중 하나는 옐로스톤 국립공원의 온천에 서식하는 박테리아 Thermus aquaticus에서 분리되었으며 Taq 중합효소라고 명명되었습니다.

PCR은 빠르게 인간 게놈 프로젝트의 주력이 되었습니다. 일반적으로 프로세스는 Mullis가 개발한 프로세스와 다르지 않으며 방금 자동화되었습니다. 우리는 더 이상 플라스틱 시험관에 액체 방울을 힘들게 붓는 멍청한 대학원생들에게 의존하지 않았습니다. 분자유전학 연구를 수행하는 현대 실험실에서는 이 작업이 로봇 컨베이어에서 수행됩니다. 인간 게놈과 같은 대규모 시퀀싱 프로젝트에 참여하는 PCR 로봇은 엄청난 양의 열 안정성 중합효소를 끊임없이 사용합니다. 인간 게놈 프로젝트에 참여하는 일부 과학자들은 PCR 특허 소유자인 유럽의 산업 제약 대기업인 호프만-라로슈가 소모품 비용에 터무니없이 높은 로열티를 추가한 것에 분노했습니다.

또 다른 "추진 원리"는 DNA 서열 분석 방법 자체였습니다. 이 방법의 화학적 기반은 당시 더 이상 새로운 것이 아니었습니다. HGP(Interstate Human Genome Project)는 Fred Sanger가 1970년대 중반에 개발한 것과 동일한 독창적인 방법을 채택했습니다. 혁신은 시퀀싱이 달성할 수 있는 자동화의 규모와 정도에 있었습니다.

자동 시퀀싱은 원래 캘리포니아 공과대학(California Institute of Technology)의 Lee Hood 연구실에서 개발되었습니다. 그는 몬타나에 있는 고등학교를 다녔고 쿼터백으로 대학 축구를 했습니다. Hood 덕분에 팀은 주 챔피언십에서 두 번 이상 우승했습니다. 그의 팀워크 기술은 과학 경력에도 도움이 되었습니다. Hood의 연구실에는 화학자, 생물학자, 엔지니어로 구성된 다양한 직원이 근무했으며, 그의 연구실은 곧 기술 혁신의 선두주자가 되었습니다.

실제로 자동화된 서열 분석 방법은 Lloyd Smith와 Mike Hunkapiller가 발명했습니다. 당시 Hood의 연구실에서 근무하던 Mike Hunkapiller는 Lloyd Smith에게 각 염기 유형의 색상이 다르게 표시되는 향상된 시퀀싱 방법에 대한 제안을 제시했습니다. 이러한 아이디어는 Sanger 프로세스의 효율성을 XNUMX배로 높일 수 있습니다. Sanger에서는 DNA 중합효소의 참여로 XNUMX개의 튜브 각각에서 염기서열을 분석할 때 프라이머 서열을 포함하여 다양한 길이의 독특한 올리고뉴클레오티드 세트가 형성됩니다. 다음으로, 사슬 분리를 위해 튜브에 포름아미드를 첨가하고 XNUMX개의 레인에 대해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하였다. Smith와 Hunkapiller의 버전에서는 디데옥시뉴클레오티드가 XNUMX가지 다른 염료로 표지되고 PCR이 하나의 튜브에서 수행됩니다. 그런 다음 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 중에 겔의 특정 위치에 있는 레이저 빔이 염료의 활성을 자극하고 검출기는 현재 겔을 통해 어떤 뉴클레오티드가 이동하고 있는지 확인합니다. 처음에 Smith는 비관적이었습니다. 그는 초저용량의 염료를 사용하면 뉴클레오티드 영역을 구별할 수 없게 될 것을 두려워했습니다. 그러나 레이저 기술에 대한 탁월한 이해를 바탕으로 그는 곧 레이저 방사선에 노출되면 형광을 발하는 특수 형광 색소 염료를 사용하여 상황에서 벗어날 수 있는 방법을 찾았습니다.

(풀 버전 클릭 할 때 - 4,08 MB) 작은 글씨: 자동 서열분석 기계에서 얻은 자동 서열분석기를 사용하여 서열분석한 DNA 서열. 각 색상은 네 가지 염기 중 하나에 해당합니다.

Sanger 방법의 고전적인 버전에서는 분석된 DNA 가닥 중 하나가 DNA 중합효소에 의한 상보적 가닥 합성을 위한 주형 역할을 한 다음 DNA 조각의 순서가 크기별로 젤에 분류됩니다. 합성 중 DNA에 포함되어 반응 생성물의 후속 시각화를 허용하는 각 단편은 말단 염기에 해당하는 형광 염료로 표지됩니다(이 내용은 124페이지에서 논의됨). 그러므로 이 단편의 형광은 주어진 염기에 대한 식별자가 될 것입니다. 그러면 남은 것은 탐지를 수행하고 반응 생성물을 시각화하는 것입니다. 결과는 컴퓨터로 분석되며 XNUMX개의 뉴클레오티드에 해당하는 일련의 다색 피크로 표시됩니다. 그런 다음 정보는 컴퓨터의 정보 시스템으로 직접 전송되므로 순서 지정을 매우 어렵게 만드는 시간 소모적이고 때로는 고통스러운 데이터 입력 프로세스가 필요하지 않습니다.

» 책에 대한 자세한 내용은 다음에서 확인할 수 있습니다. 발행인의 웹사이트
» 차례
» 발췌

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출처 : habr.com