Америкалык химия боюнча Нобель сыйлыгынын лауреаты Кэри Маллис 74 жашында Калифорнияда каза болду. Аялынын айтымында, өлүм 7-августта болгон. Себеби, пневмониядан улам жүрөк жана дем алуу органдарынын иштебей калышы.
ДНК молекуласын ачкан Джеймс Уотсон өзү биохимияга кошкон салымы жана эмне үчүн Нобель сыйлыгын алганы тууралуу айтып берет.
Джеймс Уотсон, Эндрю Берри, Кевин Дэвис китебинен үзүндү
ДНК. Генетикалык революциянын тарыхы
7-глава. Адамдын геному. Жашоо сценарийи
...
Полимераздык чынжыр реакциясын (ПТР) 1983-жылы Цетуда иштеген биохимик Кэри Муллис ойлоп тапкан. Бул реакциянын ачылышы абдан таң калыштуу болду. Муллис кийинчерээк мындай деп эскерет: «1983-жылы апрель айынын бир жума күнү кечинде мен бир нерсени сездим. Мен рулда элем, ай жарык, ийри-буйру тоо жолунда, Түндүк Калифорнияда, кызыл жыгач токойлорунун жеринде бараттым». Дал ушундай кырдаалда ага илхам тийгени таасирдүү. Ал эми түндүк Калифорнияда түшүнүккө көмөктөшүүчү атайын жолдор бар эмес; жөн гана анын досу бир жолу Муллистин муз каптаган кош жол жээгинде абайсыздык менен ылдамдыкта келе жатканын көрүп, аны такыр тынчсыздандырган эмес. Бир досу New York Times гезитине: «Муллис кызыл даракка урунуп өлөт деп аян көргөн. Ошондуктан жол боюнда кызыл дарактар өспөсө, айдап баратып эч нерседен коркпойт». Жолдун боюндагы кызыл дарактардын болушу Муллисти көңүлүн топтоого мажбурлады жана... бул жерде түшүнүктүү болду. Муллис 1993-жылы ойлоп табуусу үчүн химия боюнча Нобель сыйлыгын алган жана андан бери өзүнүн иш-аракеттери менен бөтөнчө болуп калды. Мисалы, ал СПИДдин ВИЧке тиешеси жок деген ревизионисттик теориянын жактоочусу, бул анын өзүнүн аброюна олуттуу доо кетирип, дарыгерлерге кийлигишкен.
ПЦР – бул өтө жөнөкөй реакция. Аны ишке ашыруу үчүн бизге керектүү ДНК фрагментинин ар кандай тилкелеринин карама-каршы учтарын толуктоочу эки химиялык синтезделген праймер керек. Праймерлер – ар биринин узундугу 20га жакын негизги жуп болгон бир тизмектүү ДНКнын кыска бөлүктөрү. Праймерлердин өзгөчөлүгү, алар күчөтүлүшү керек болгон ДНК бөлүмдөрүнө, башкача айтканда, ДНК шаблонуна туура келет.
(Сүрөт чыкылдатуу) Кари Муллис, ПТРдин ойлоп табуучусу
ПЦРдин өзгөчөлүгү шаблон менен праймерлер, кыска синтетикалык олигонуклеотиддер ортосунда комплементарлык комплекстердин пайда болушуна негизделген. Ар бир праймер кош тилкелүү шаблондун жиптеринин бирине кошумча болуп саналат жана күчөтүлгөн аймактын башын жана аягын чектейт. Чынында, пайда болгон "матрица" бүтүндөй бир геном жана биздин максат андан бизди кызыктырган фрагменттерди бөлүп алуу. Бул үчүн, ДНК тилкелерин бөлүп алуу үчүн, эки тилкелүү ДНК шаблону бир нече мүнөт 95 °C чейин ысытылат. Бул этап денатурация деп аталат, анткени эки ДНК тилкесинин ортосундагы суутек байланыштары үзүлгөн. Жиптер бөлүнгөндөн кийин, праймерлердин бир жиптүү калыпка байланышы үчүн температура төмөндөтүлөт. ДНК полимераза нуклеотиддик чынжырдын бир бөлүгү менен байланышып, ДНКнын репликациясын баштайт. ДНК полимераза ферменти праймер же көчүрүү үчүн мисал катары праймерди колдонуп, шаблон тилкесин репликациялайт. Биринчи циклдин натыйжасында биз белгилүү бир ДНКнын бир нече ырааттуу эки эсеге көбөйүшүн алабыз. Андан кийин биз бул процедураны кайталайбыз. Ар бир циклден кийин биз эки эселенген максаттуу аймакты алабыз. Жыйырма беш ПТР циклинен кийин (башкача айтканда, эки сааттан азыраак убакытта) бизде ДНКнын аймагы түпнускадан 225 эсе жогору (башкача айтканда, биз аны болжол менен 34 миллион эсе күчөттүк). Чынында, киргизүүдө биз праймерлердин аралашмасын, ДНК шаблонун, ДНК полимераза ферментин жана эркин негиздер A, C, G жана T алдык, белгилүү бир реакция продуктунун көлөмү (праймерлер менен чектелген) экспоненциалдуу түрдө өсөт жана саны "узун" ДНК көчүрмөлөрү сызыктуу, ошондуктан реакцияда продуктулар басымдуулук кылат.
Керектүү ДНК бөлүмүн күчөтүү: полимераздык чынжыр реакциясы
ПТРдин алгачкы күндөрүндө негизги көйгөй төмөнкүдөй болгон: ар бир жылытуу-муздатуу циклинен кийин реакция аралашмасына ДНК-полимеразаны кошуу керек болчу, анткени ал 95°С температурада инактивацияланган. Ошондуктан 25 циклдин ар биринин алдында аны кайра кошуу керек болчу. Реакция процедурасы салыштырмалуу натыйжасыз болгон, көп убакытты жана полимераз ферментин талап кылган жана материал абдан кымбат болгон. Бактыга жараша Жаратылыш эне жардамга келди. Көптөгөн жаныбарлар 37 °Cден бир топ жогору температурада өздөрүн ыңгайлуу сезишет. Эмне үчүн 37 °C көрсөткүчү биз үчүн маанилүү болуп калды? Бул температура E. coli үчүн оптималдуу болгондуктан, ПТР үчүн полимераз ферменти алгач алынган. Жаратылышта микроорганизмдер бар, алардын протеиндери миллиондогон жылдар бою табигый тандалуунун натыйжасында жогорку температурага туруктуураак болуп калган. Термофильдуу бактериялардан ДНК-полимеразаларды колдонуу сунушталды. Бул ферменттер термостабилдүү болуп чыкты жана көптөгөн реакция циклдерине туруштук бере алышкан. Аларды колдонуу ПЦРди жөнөкөйлөтүүгө жана автоматташтырууга мүмкүндүк берди. Биринчи термостабилдүү ДНК полимеразаларынын бири Йеллоустоун улуттук паркынын ысык булактарында жашаган Thermus aquaticus бактериясынан бөлүнүп алынган жана Так полимераза деп аталган.
ПЦР тез эле Адам геномунун долбоорунун негизи болуп калды. Жалпысынан алганда, процесс Муллис иштеп чыккан процесстен эч айырмаланбайт, ал жаңы эле автоматташтырылган. Биз мындан ары пластикалык пробиркаларга суюктуктун тамчыларын талыкпай куюп жаткан акылы аз, аспиранттардын тобуна көз каранды болбой калдык. Молекулярдык-генетикалык изилдөөлөрдү жүргүзгөн заманбап лабораторияларда бул иш роботтук конвейерлерде аткарылат. Адам геному сыяктуу чоң секвенирлөө долбооруна катышкан ПТР роботтору ысыкка туруктуу полимеразанын чоң көлөмү менен тынымсыз иштешет. Адам геному долбоору боюнча иштеген кээ бир илимпоздор ПЦР патентинин ээси, европалык өнөр жай фармацевтикалык гиганты Хоффман-ЛаРош тарабынан сарпталуучу материалдардын баасына кошулган негизсиз жогору роялтиге нааразы болушкан.
Дагы бир "айдоо принциби" ДНК секвенирлөө ыкмасынын өзү эле. Бул ыкманын химиялык негизи ошол убакта жаңы эмес болчу: Мамлекеттер аралык Адам геному долбоору (HGP) Фред Сэнгер 1970-жылдардын ортосунда иштеп чыккан ошол эле гениалдуу ыкманы кабыл алган. Инновация секвенирлөө жетише алган автоматташтыруунун масштабында жана даражасында болгон.
Автоматташтырылган секвенирлөө алгач Калифорния технологиялык институтунда Ли Гуддун лабораториясында иштелип чыккан. Ал Монтанадагы орто мектепте окуган жана коллежде футбол ойногон; Гуд аркасында команда мамлекеттик биринчиликти бир нече жолу жеңип алды. Анын коллективде иштөө жөндөмү анын илимий карьерасында да пайдалуу болгон. Гуддун лабораториясында химиктердин, биологдордун жана инженерлердин көп кырдуу бригадасы иштеген жана анын лабораториясы тез арада технологиялык инновациялардын лидери болуп калды.
Чынында, автоматташтырылган секвенирлөө ыкмасын Ллойд Смит жана Майк Хункапиллер ойлоп табышкан. Ошол кезде Гуддун лабораториясында иштеген Майк Хункапиллер Ллойд Смитке базанын ар бир түрү башкача түстө боло турган жакшыртылган секвенирлөө ыкмасын сунуштоо менен кайрылган. Мындай идея Сэнгер процессинин натыйжалуулугун төрт эсеге көбөйтүшү мүмкүн. Сэнгерде төрт түтүктүн ар биринде (негиздердин санына жараша) секвенирлөөдө ДНК-полимеразанын катышуусу менен ар түрдүү узундуктагы олигонуклеотиддердин уникалдуу топтому пайда болот, анын ичинде праймер ырааттуулугу. Андан кийин чынжырды бөлүү үчүн түтүктөргө формамид кошулду жана төрт тилкеде полиакриламиддик гель электрофорези жасалды. Смит жана Хункапиллердин версиясында дидеоксинуклеотиддер төрт түрдүү боёк менен белгиленет жана ПТР бир түтүктө жүргүзүлөт. Андан кийин, полиакриламиддик гелдик электрофорез учурунда гелдин белгилүү бир жериндеги лазер нуру боёктордун активдүүлүгүн козгойт жана детектор учурда гел аркылуу кайсы нуклеотид миграциялап жатканын аныктайт. Адегенде Смит пессимисттик маанайда болгон - ал боёктун өтө төмөн дозаларын колдонуу нуклеотиддик аймактардын айырмаланбай калышына алып келет деп корккон. Бирок, лазердик технологияны эң сонун түшүнгөндүктөн, ал лазердик нурлануунун таасири астында флуоресценцияланган атайын флюорхромдук боёкторду колдонуу менен абалдан чыгуунун жолун тапты.
(Толук версия - 4,08 МБ) Жакшы басып чыгаруу: автоматтык секвенирлөөчү машинадан алынган, автоматтык секвенерди колдонуу менен секвенирленген ДНК ырааттуулугу. Ар бир түс төрт негиздин бирине туура келет
Сэнгер методунун классикалык вариантында анализденген ДНКнын тилкелеринин бири ДНК-полимераза ферменти тарабынан комплементарлык тизмектин синтези үчүн шаблон катары иштейт, андан кийин ДНК фрагменттеринин ырааттуулугу гельде өлчөмү боюнча сорттолот. Синтез учурунда ДНКга кирген жана реакция продуктыларын кийинки визуалдаштырууга мүмкүндүк берүүчү ар бир фрагмент терминалдык базага ылайыктуу флуоресценттик боёк менен белгиленет (бул 124-бетте талкууланган); ошондуктан бул фрагменттин флуоресценциясы берилген база үчүн идентификатор болот. Андан кийин реакция продуктыларын аныктоо жана визуалдаштыруу гана калды. Натыйжалар компьютер аркылуу талданат жана төрт нуклеотидге туура келген көп түстүү чокулардын ырааттуулугу катары көрсөтүлөт. Андан кийин маалымат түздөн-түз компьютердин маалымат тутумуна өткөрүлүп берилет, бул секвенирлөө өтө кыйынга турган көп убакытты талап кылган жана кээде азаптуу маалыматтарды киргизүү процессин жокко чыгарат.
» Китеп тууралуу кененирээк бул жерден тапса болот
»
»
Khabrozhiteley үчүн купонду колдонуу менен 25% арзандатуу - ПЦР
Source: www.habr.com