Kalifornijoje, būdamas 74 metų, mirė amerikietis Nobelio chemijos premijos laureatas Kary Mullis. Pasak jo žmonos, mirtis ištiko rugpjūčio 7 d. Priežastis yra širdies ir kvėpavimo nepakankamumas dėl plaučių uždegimo.
Pats Jamesas Watsonas, DNR molekulės atradėjas, pasakos apie savo indėlį į biochemiją ir už ką gavo Nobelio premiją.
Ištrauka iš Jameso Watsono, Andrew Berry, Kevino Daviso knygos
DNR. Genetinės revoliucijos istorija
7 skyrius. Žmogaus genomas. Gyvenimo scenarijus
...
Polimerazės grandininę reakciją (PGR) 1983 metais išrado biochemikas Carey Mullis, dirbęs Cetus. Šios reakcijos atradimas buvo gana nuostabus. Vėliau Mullis prisiminė: „Vieną 1983 m. balandžio mėnesio penktadienio vakarą išgyvenau epifaniją. Sėdėjau už vairo ir važiavau mėnulio apšviestu, vingiuotu kalnų keliu Šiaurės Kalifornijoje, sekvojų miškų šalyje. Įspūdinga, kad būtent tokioje situacijoje jį užklupo įkvėpimas. Ir ne tai, kad Šiaurės Kalifornijoje yra ypatingi keliai, skatinantys įžvalgą; tiesiog jo draugas kartą pamatė Mullis beatodairiškai lekiantį greitį apledėjusia dviguba važiuojamąja kelio dalimi ir tai jo nė kiek nejaudino. Draugas „New York Times“ pasakojo: „Mullis turėjo viziją, kad jis mirs atsitrenkęs į sekvoją. Todėl važiuodamas jis nieko nebijo, nebent palei kelią auga sekvojos.“ Sevojų buvimas kelyje privertė Mullis susikaupti ir... štai, įžvalga. Mullis gavo Nobelio chemijos premiją už savo išradimą 1993 m. ir nuo to laiko savo veiksmais tapo dar keistesnis. Pavyzdžiui, jis remia revizionistinę teoriją, kad AIDS nėra susijęs su ŽIV, o tai gerokai pakenkė jo paties reputacijai ir trukdė gydytojams.
PGR yra gana paprasta reakcija. Norėdami tai atlikti, mums reikia dviejų chemiškai susintetintų pradmenų, kurie papildytų priešingus skirtingų reikalingo DNR fragmento gijų galus. Pradmenys yra trumpos vienos grandinės DNR dalys, kurių kiekviena yra apie 20 bazinių porų. Pradmenų ypatumas yra tas, kad jie atitinka DNR dalis, kurias reikia amplifikuoti, tai yra DNR šabloną.
(Spustelėti vaizdą) Kary Mullis, PGR išradėjas
PGR specifiškumas pagrįstas komplementarių kompleksų susidarymu tarp šablono ir pradmenų, trumpų sintetinių oligonukleotidų. Kiekvienas pradmuo papildo vieną iš dvigrandinio šablono gijų ir riboja sustiprintos srities pradžią ir pabaigą. Tiesą sakant, gauta „matrica“ yra visas genomas, o mūsų tikslas yra iš jo izoliuoti mus dominančius fragmentus. Norėdami tai padaryti, dvigrandė DNR šablonas keletą minučių kaitinamas iki 95 °C, kad būtų atskirtos DNR grandinės. Šis etapas vadinamas denatūravimu, nes nutrūksta vandenilio ryšiai tarp dviejų DNR grandžių. Kai sruogos atsiskiria, temperatūra sumažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. DNR polimerazė pradeda DNR replikaciją prisijungdama prie nukleotidų grandinės ruožo. Fermento DNR polimerazė replikuoja šablono grandinę, naudodama pradmenį kaip pradmenį arba kopijavimo pavyzdį. Pirmojo ciklo rezultate gauname daugkartinį nuoseklų tam tikros DNR dalies padvigubinimą. Toliau šią procedūrą kartojame. Po kiekvieno ciklo gauname dvigubą tikslinę sritį. Po dvidešimt penkių PGR ciklų (ty mažiau nei per dvi valandas) mus dominančios DNR srities kiekis yra 225 kartus didesnis nei originalus (tai yra, mes jį padidinome maždaug 34 milijonus kartų). Tiesą sakant, įvestyje gavome pradmenų, šabloninės DNR, DNR polimerazės fermento ir laisvųjų bazių A, C, G ir T mišinį, konkretaus reakcijos produkto kiekis (ribojamas pradmenų) auga eksponentiškai, o skaičius. „ilgų“ DNR kopijų yra linijinė, todėl reakcijose dominuoja produktai.
Norimos DNR sekcijos amplifikacija: polimerazės grandininė reakcija
Pirmosiomis PGR dienomis pagrindinė problema buvo tokia: po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo į reakcijos mišinį reikėjo pridėti DNR polimerazę, nes ji buvo inaktyvuota 95 ° C temperatūroje. Todėl jį reikėjo iš naujo pridėti prieš kiekvieną iš 25 ciklų. Reakcijos procedūra buvo gana neefektyvi, pareikalavo daug laiko ir polimerazės fermento, o medžiaga buvo labai brangi. Laimei, motina gamta atėjo į pagalbą. Daugelis gyvūnų jaučiasi patogiai esant aukštesnei nei 37 °C temperatūrai. Kodėl mums tapo svarbus skaičius 37 °C? Taip atsitiko todėl, kad ši temperatūra yra optimali E. coli, iš kurios iš pradžių buvo gautas polimerazės fermentas PGR. Gamtoje yra mikroorganizmų, kurių baltymai per milijonus natūralios atrankos metų tapo atsparesni aukštai temperatūrai. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir galėjo atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš Jeloustouno nacionalinio parko karštuosiuose šaltiniuose gyvenančios bakterijos Thermus aquaticus ir pavadinta Taq polimeraze.
PGR greitai tapo žmogaus genomo projekto arkliu. Apskritai procesas niekuo nesiskiria nuo Mullis sukurto, jis ką tik buvo automatizuotas. Mes nebebuvome priklausomi nuo minios silpnaprotiškų abiturientų, kruopščiai pilančių skysčio lašelius į plastikinius mėgintuvėlius. Šiuolaikinėse laboratorijose, atliekančiose molekulinius genetinius tyrimus, šis darbas atliekamas ant robotų konvejerių. PGR robotai, dalyvaujantys tokio dydžio sekvenavimo projekte kaip Žmogaus genomas, nenumaldomai dirba su didžiuliais karščiui stabilios polimerazės kiekiais. Kai kurie mokslininkai, dirbantys su Žmogaus genomo projektu, buvo pasipiktinę PGR patento savininko – Europos pramoninės farmacijos milžinės „Hoffmann-LaRoche“ – nepagrįstai dideliais honorarais.
Kitas „varomasis principas“ buvo pats DNR sekos nustatymo metodas. Cheminis šio metodo pagrindas tuo metu jau nebuvo naujas: tarpvalstybinis žmogaus genomo projektas (HGP) priėmė tą patį genialų metodą, kurį Fredas Sangeris sukūrė dar aštuntojo dešimtmečio viduryje. Naujovė slypi automatizavimo mastelyje ir laipsnyje, kurį pavyko pasiekti sekos nustatymu.
Automatizuotas sekos nustatymas iš pradžių buvo sukurtas Lee Hood laboratorijoje Kalifornijos technologijos institute. Jis lankė vidurinę mokyklą Montanoje ir žaidė koledžo futbolą kaip gynėjas; Hudo dėka komanda ne kartą laimėjo valstybės čempionatą. Jo komandinio darbo įgūdžiai taip pat pravertė mokslinėje karjeroje. Hudo laboratorijoje dirbo marga chemikų, biologų ir inžinierių komanda, o jo laboratorija netrukus tapo technologinių naujovių lydere.
Tiesą sakant, automatinį sekos nustatymo metodą išrado Lloydas Smithas ir Mike'as Hunkapiller. Mike'as Hunkapilleris, tuomet dirbęs Hudo laboratorijoje, kreipėsi į Lloydą Smithą su pasiūlymu dėl patobulinto sekos nustatymo metodo, pagal kurį kiekvieno tipo pagrindas būtų spalvinamas skirtingai. Tokia idėja galėtų keturis kartus padidinti Sangerio proceso efektyvumą. Sangeryje, atliekant seką kiekviename iš keturių mėgintuvėlių (pagal bazių skaičių), dalyvaujant DNR polimerazei, susidaro unikalus skirtingo ilgio oligonukleotidų rinkinys, įskaitant pradmenų seką. Tada į vamzdelius buvo pridėta formamido grandinės atskyrimui, o poliakrilamido gelio elektroforezė buvo atlikta keturiose juostose. Smith ir Hunkapiller versijoje dideoksinukleotidai yra paženklinti keturiais skirtingais dažais, o PGR atliekama viename mėgintuvėlyje. Tada poliakrilamido gelio elektroforezės metu lazerio spindulys tam tikroje gelio vietoje sužadina dažų aktyvumą, o detektorius nustato, kuris nukleotidas šiuo metu migruoja per gelį. Iš pradžių Smithas buvo nusiteikęs pesimistiškai – bijojo, kad naudojant itin mažas dažų dozes nukleotidų regionai taps neatskiriami. Tačiau puikiai išmanydamas lazerines technologijas, netrukus rado išeitį iš padėties – panaudojo specialius fluorochromo dažus, kurie fluorescuoja veikiami lazerio spinduliuotės.
(Pilna versija - 4,08 MB) Smulkiu šriftu: DNR seka, sekvenuota naudojant automatinį sekvenavimo įrenginį, gauta iš automatinio sekos nustatymo įrenginio. Kiekviena spalva atitinka vieną iš keturių bazių
Klasikinėje Sanger metodo versijoje viena iš analizuojamos DNR grandžių veikia kaip šablonas, skirtas papildomos grandinės sintezei naudojant fermentą DNR polimerazę, tada DNR fragmentų seka rūšiuojama gelyje pagal dydį. Kiekvienas fragmentas, kuris sintezės metu įtraukiamas į DNR ir leidžia vėliau vizualizuoti reakcijos produktus, yra paženklintas fluorescenciniu dažikliu, atitinkančiu galinę bazę (apie tai buvo kalbama p. 124); todėl šio fragmento fluorescencija bus tam tikros bazės identifikatorius. Tada belieka atlikti aptikimą ir vizualizuoti reakcijos produktus. Rezultatai analizuojami kompiuteriu ir pateikiami kaip daugiaspalvių smailių seka, atitinkanti keturis nukleotidus. Tada informacija perduodama tiesiai į kompiuterio informacinę sistemą, pašalinant daug laiko reikalaujantį ir kartais skausmingą duomenų įvedimo procesą, kuris labai apsunkino sekos nustatymą.
» Daugiau informacijos apie knygą rasite adresu
»
»
Khabrozhiteley 25% nuolaida naudojant kuponą - PGR
Šaltinis: www.habr.com