Kalifornijā 74 gadu vecumā miris amerikāņu Nobela prēmijas laureāts ķīmijā Karijs Muliss. Pēc sievas teiktā, nāve iestājusies 7.augustā. Cēlonis ir sirds un elpošanas mazspēja pneimonijas dēļ.
Pats Džeimss Vatsons, DNS molekulas atklājējs, pastāstīs par viņa ieguldījumu bioķīmijā un par ko viņš saņēma Nobela prēmiju.
Fragments no Džeimsa Vatsona, Endrjū Berija, Kevina Deivisa grāmatas
DNS. Ģenētiskās revolūcijas vēsture
7. nodaļa. Cilvēka genoms. Dzīves scenārijs
...
Polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) 1983. gadā izgudroja bioķīmiķis Kerijs Mulliss, kurš strādāja uzņēmumā Cetus. Šīs reakcijas atklāšana bija diezgan ievērojama. Mullis vēlāk atcerējās: ”Kādu piektdienas vakaru 1983. gada aprīlī man bija epifānija. Es sēdēju pie stūres un braucu pa mēness apspīdētu, līkumotu kalnu ceļu Ziemeļkalifornijā, sekvoju mežu zemē. Iespaidīgi, ka tieši šādā situācijā viņu pārsteidza iedvesma. Un nav tā, ka Kalifornijas ziemeļos ir īpaši ceļi, kas veicina ieskatu; vienkārši viņa draugs reiz redzēja, kā Mullis neapdomīgi traucās pa apledojušu dubultu brauktuvi un tas viņu nemaz netraucēja. Kāds draugs laikrakstam New York Times stāstīja: “Mullisam bija vīzija, ka viņš nomirs, ietriecoties sarkankokā. Tāpēc viņš ne no kā nebaidās braucot, ja vien gar ceļu neaug sekvojumi.» Sevojas klātbūtne gar ceļu lika Mulsam koncentrēties un... lūk, ieskats. Mullis saņēma Nobela prēmiju ķīmijā par savu izgudrojumu 1993. gadā un kopš tā laika ir kļuvis vēl dīvaināks savā darbībā. Piemēram, viņš atbalsta revizionisma teoriju, ka AIDS nav saistīta ar HIV, kas būtiski iedragāja viņa paša reputāciju un traucēja ārstiem.
PCR ir diezgan vienkārša reakcija. Lai to īstenotu, mums ir nepieciešami divi ķīmiski sintezēti praimeri, kas ir komplementāri vajadzīgā DNS fragmenta dažādu virkņu pretējiem galiem. Praimeri ir īsas vienpavedienu DNS daļas, katra aptuveni 20 bāzes pāru garumā. Praimeru īpatnība ir tāda, ka tie atbilst DNS sekcijām, kuras ir jāpastiprina, tas ir, DNS veidnei.
(Attēls ir noklikšķināms) Kary Mullis, PCR izgudrotājs
PCR specifika ir balstīta uz komplementāru kompleksu veidošanos starp šablonu un praimeriem, īsiem sintētiskiem oligonukleotīdiem. Katrs primer papildina vienu no divpavedienu veidnes pavedieniem un ierobežo pastiprinātā reģiona sākumu un beigas. Faktiski iegūtā “matrica” ir vesels genoms, un mūsu mērķis ir no tā izolēt mūs interesējošos fragmentus. Lai to izdarītu, divpavedienu DNS veidni vairākas minūtes karsē līdz 95 °C, lai atdalītu DNS virknes. Šo posmu sauc par denaturāciju, jo ūdeņraža saites starp abām DNS virknēm ir pārrautas. Kad pavedieni ir atdalījušies, temperatūra tiek pazemināta, lai ļautu gruntskrāsām piesaistīties vienpavediena veidnei. DNS polimerāze sāk DNS replikāciju, saistoties ar nukleotīdu ķēdes posmu. Fermenta DNS polimerāze replikē veidnes virkni, izmantojot praimeri kā praimeri vai piemēru kopēšanai. Pirmā cikla rezultātā mēs iegūstam noteiktas DNS sekcijas vairākkārtēju secīgu dubultošanu. Tālāk mēs atkārtojam šo procedūru. Pēc katra cikla mēs iegūstam mērķa apgabalu dubultā daudzumā. Pēc divdesmit pieciem PCR cikliem (tas ir, mazāk nekā divās stundās) mums interesējošais DNS reģions ir 225 reizes lielāks nekā oriģināls (tas ir, mēs to esam pastiprinājuši aptuveni 34 miljonus reižu). Faktiski ievades laikā mēs saņēmām praimeru, šablona DNS, DNS polimerāzes enzīma un brīvo bāzu A, C, G un T maisījumu, specifiskā reakcijas produkta daudzums (ierobežots ar praimeriem) pieaug eksponenciāli, un garas” DNS kopijas ir lineāras, tāpēc dominē reakcijas produkti.
Vēlamās DNS sekcijas pastiprināšana: polimerāzes ķēdes reakcija
PCR pirmajās dienās galvenā problēma bija šāda: pēc katra sildīšanas-dzesēšanas cikla reakcijas maisījumam bija jāpievieno DNS polimerāze, jo tā tika inaktivēta 95 ° C temperatūrā. Tāpēc bija nepieciešams to atkārtoti pievienot pirms katra no 25 cikliem. Reakcijas procedūra bija salīdzinoši neefektīva, prasīja daudz laika un polimerāzes enzīma, un materiāls bija ļoti dārgs. Par laimi, māte daba nāca palīgā. Daudzi dzīvnieki jūtas ērti, ja temperatūra ir daudz augstāka par 37 °C. Kāpēc skaitlis 37 °C mums kļuva svarīgs? Tas notika tāpēc, ka šī temperatūra ir optimāla E. coli, no kuras sākotnēji tika iegūts polimerāzes enzīms PCR. Dabā ir mikroorganismi, kuru proteīni miljoniem gadu dabiskās atlases laikā ir kļuvuši izturīgāki pret augstām temperatūrām. Ir ierosināts izmantot termofīlo baktēriju DNS polimerāzes. Šie fermenti izrādījās termostabīli un spēja izturēt daudzus reakcijas ciklus. To izmantošana ļāva vienkāršot un automatizēt PCR. Viena no pirmajām termostabilajām DNS polimerāzēm tika izolēta no baktērijas Thermus aquaticus, kas dzīvo Jeloustonas nacionālā parka karstajos avotos, un tika nosaukta par Taq polimerāzi.
PCR ātri kļuva par cilvēka genoma projekta darba zirgu. Kopumā process ne ar ko neatšķiras no Mullis izstrādātā, nupat tas ir automatizēts. Mēs vairs nebijām atkarīgi no vājprātīgu absolventu pūļa, kas cītīgi lej šķidruma pilienus plastmasas mēģenēs. Mūsdienu laboratorijās, kas veic molekulāro ģenētisko izpēti, šis darbs tiek veikts uz robotizētiem konveijeriem. PCR roboti, kas iesaistīti sekvencēšanas projektā, kas ir tik liels kā Cilvēka genoms, neatlaidīgi strādā ar milzīgiem karstumizturīgas polimerāzes apjomiem. Daži zinātnieki, kas strādā pie Cilvēka genoma projekta, bija sašutuši par nepamatoti augstajiem honorāriem, ko palīgmateriālu izmaksām pievienoja PCR patenta īpašnieks, Eiropas rūpnieciskās farmācijas gigants Hoffmann-LaRoche.
Vēl viens “vadīšanas princips” bija pati DNS sekvencēšanas metode. Šīs metodes ķīmiskā bāze tajā laikā vairs nebija jauna: starpvalstu cilvēka genoma projekts (HGP) pieņēma to pašu ģeniālo metodi, ko Freds Sangers bija izstrādājis 1970. gadu vidū. Inovācija slēpjas automatizācijas mērogā un pakāpē, ko varēja sasniegt sekvencēšana.
Automatizētā sekvencēšana sākotnēji tika izstrādāta Lī Huda laboratorijā Kalifornijas Tehnoloģiju institūtā. Viņš apmeklēja vidusskolu Montānā un spēlēja koledžas futbolu kā aizsargs; Pateicoties Hudam, komanda ne reizi vien uzvarēja valsts čempionātā. Viņa komandas darba prasmes noderēja arī viņa zinātniskajā karjerā. Huda laboratorijā strādāja raiba ķīmiķu, biologu un inženieru komanda, un viņa laboratorija drīz kļuva par tehnoloģisko inovāciju līderi.
Faktiski automatizēto sekvencēšanas metodi izgudroja Loids Smits un Maiks Hunkapillers. Maiks Hunkapillers, kurš toreiz strādāja Huda laboratorijā, vērsās pie Loida Smita ar priekšlikumu par uzlabotu sekvencēšanas metodi, kurā katrs bāzes veids tiktu krāsots atšķirīgi. Šāda ideja varētu četrkāršot Sanger procesa efektivitāti. Sangerā, veicot sekvencēšanu katrā no četrām mēģenēm (pēc bāzu skaita), piedaloties DNS polimerāzei, veidojas unikāls dažāda garuma oligonukleotīdu kopums, ieskaitot praimeru secību. Pēc tam mēģenēm tika pievienots formamīds ķēdes atdalīšanai, un četrās joslās tika veikta poliakrilamīda gēla elektroforēze. Smith un Hunkapiller versijā dideoksinukleotīdi ir marķēti ar četrām dažādām krāsvielām, un PCR tiek veikta vienā mēģenē. Pēc tam poliakrilamīda gēla elektroforēzes laikā lāzera stars noteiktā vietā uz gēla ierosina krāsvielu aktivitāti, un detektors nosaka, kurš nukleotīds pašlaik migrē caur gēlu. Sākumā Smits bija pesimistisks - viņš baidījās, ka ļoti zemu krāsvielu devu izmantošana novedīs pie tā, ka nukleotīdu reģionus nevarēs atšķirt. Taču, lieliski pārzinot lāzertehnoloģiju, viņš drīz vien atrada izeju no situācijas, izmantojot īpašas fluorohroma krāsvielas, kas fluorescē, pakļaujoties lāzera starojumam.
(Pilna versija - 4,08 MB) Sīkā druka: DNS sekvencēšana, kas sekvencēta, izmantojot automātisko sekvencētāju, iegūta no automātiskās sekvencēšanas iekārtas. Katra krāsa atbilst vienai no četrām bāzēm
Klasiskajā Sanger metodes versijā viena no analizētās DNS virknēm darbojas kā veidne komplementāras virknes sintēzei ar enzīmu DNS polimerāzi, pēc tam DNS fragmentu secība tiek sakārtota gēlā pēc izmēra. Katrs fragments, kas ir iekļauts DNS sintēzes laikā un ļauj vēlāk vizualizēt reakcijas produktus, tiek marķēts ar fluorescējošu krāsvielu, kas atbilst gala bāzei (par to tika runāts 124. lpp.); tādēļ šī fragmenta fluorescence būs noteiktas bāzes identifikators. Tad atliek tikai veikt noteikšanu un vizualizēt reakcijas produktus. Rezultāti tiek analizēti ar datoru un parādīti kā daudzkrāsainu pīķu secība, kas atbilst četriem nukleotīdiem. Pēc tam informācija tiek pārsūtīta tieši uz datora informācijas sistēmu, novēršot laikietilpīgo un dažkārt sāpīgo datu ievades procesu, kas ļoti sarežģīja secību noteikšanu.
» Sīkāku informāciju par grāmatu var atrast vietnē
»
»
Par Khabrozhiteley 25% atlaide, izmantojot kuponu - PCR
Avots: www.habr.com