Почина нобеловката Кари Мулис, пронаоѓач на верижната реакција на ДНК полимераза

Американската нобеловка за хемија Кари Мулис почина во Калифорнија на 74-годишна возраст. Според неговата сопруга, смртта настапила на 7 август. Причината е срцева и респираторна инсуфициенција поради пневмонија.

Самиот Џејмс Вотсон, откривачот на молекулата на ДНК, ќе ни раскаже за неговиот придонес во биохемијата и за кој ја доби Нобеловата награда.

Извадок од книгата на Џејмс Вотсон, Ендру Бери, Кевин Дејвис

ДНК. Историја на генетската револуција

Поглавје 7. Човечки геном. Животно сценарио

...
Полимеразната верижна реакција (PCR) била измислена во 1983 година од биохемичарот Кери Малис, кој работел во Цетус. Откривањето на оваа реакција беше прилично извонредно. Малис подоцна се присети: „Еден петок навечер во април 1983 година, имав Богојавление. Бев зад воланот, возејќи по планински пат осветлен од месечина во северна Калифорнија, земјата на шумите на црвено дрво“. Импресивно е што токму во таква ситуација го погодила инспирација. И не е дека северна Калифорнија има посебни патишта кои промовираат увид; само што неговиот пријател еднаш го виде Малис како невнимателно се движи по ледениот двоен коловоз и тоа воопшто не му пречеше. Еден пријател за Њујорк Тајмс рекол: „Малис имал визија дека ќе умре удирајќи во дрво од црвено дрво. Затоа, тој не се плаши од ништо додека вози, освен ако покрај патот не растат дрва од црвено дрво“. Присуството на црвени дрва покрај патот го принуди Мулис да се концентрира и... еве го, увид. Мулис ја доби Нобеловата награда за хемија за својот изум во 1993 година и оттогаш стана уште почуден во своите постапки. На пример, тој е поддржувач на ревизионистичката теорија дека СИДА-та не е поврзана со ХИВ, што значително го поткопа неговиот углед и се меша со лекарите.

PCR е прилично едноставна реакција. За да го спроведеме, потребни ни се два хемиски синтетизирани прајмери ​​кои се комплементарни со спротивните краеви на различните нишки од потребниот ДНК фрагмент. Прајмерите се кратки делови од едноверижна ДНК, секој со должина од околу 20 базни парови. Особеноста на прајмерите е тоа што тие одговараат на деловите на ДНК што треба да се засилат, односно на шаблонот на ДНК.

(Кликнување на сликата) Кари Малис, пронаоѓач на PCR

Специфичноста на PCR се заснова на формирање на комплементарни комплекси помеѓу шаблонот и прајмерите, кратки синтетички олигонуклеотиди. Секој прајмер е комплементарен на една од нишките на двоверижниот шаблон и го ограничува почетокот и крајот на засилениот регион. Всушност, добиената „матрица“ е цел геном и нашата цел е да ги изолираме фрагментите што ни се интересни од него. За да го направите ова, шаблонот со двоверижна ДНК се загрева до 95 °C неколку минути за да се разделат нишките на ДНК. Оваа фаза се нарекува денатурација бидејќи водородните врски помеѓу двете ДНК нишки се прекинати. Откако ќе се разделат нишките, температурата се намалува за да им се овозможи на прајмерите да се врзат за едножичниот шаблон. ДНК полимеразата започнува со репликација на ДНК со врзување за протегање на нуклеотидниот синџир. Ензимот ДНК полимераза ја реплицира низата на шаблонот користејќи прајмер како прајмер или пример за копирање. Како резултат на првиот циклус, добиваме повеќекратно секвенцијално удвојување на одреден дел од ДНК. Следно, ја повторуваме оваа постапка. По секој циклус добиваме целна површина во двојна количина. По дваесет и пет циклуси на PCR (т.е. за помалку од два часа), го имаме ДНК-регионот што ни е интересен во количина 225 пати поголема од оригиналната (т.е. ја засиливме приближно 34 милиони пати). Всушност, на влезот добивме мешавина од прајмери, шаблон ДНК, ензимот ДНК полимераза и слободни бази A, C, G и T, количината на специфичен производ на реакција (ограничена од прајмерите) расте експоненцијално, а бројот на „долгите“ копии на ДНК е линеарна, така што во реакцијата доминираат производите.

Засилување на саканиот ДНК дел: полимеразна верижна реакција

Во раните денови на PCR, главниот проблем беше следниот: по секој циклус на загревање-ладење, ДНК полимеразата требаше да се додаде во реакционата смеса, бидејќи беше инактивирана на температура од 95 ° C. Затоа, беше неопходно повторно да се додаде пред секој од 25-те циклуси. Процедурата на реакција беше релативно неефикасна, бараше многу време и ензимот полимераза, а материјалот беше многу скап. За среќа, мајката природа дојде на помош. Многу животни се чувствуваат удобно на температури многу повисоки од 37 °C. Зошто бројката 37 °C стана важна за нас? Ова се случи бидејќи оваа температура е оптимална за E. coli, од која првично беше добиен полимеразниот ензим за PCR. Во природата постојат микроорганизми чии протеини, во текот на милиони години природна селекција, станале поотпорни на високи температури. Предложено е да се користат ДНК полимерази од термофилни бактерии. Овие ензими се покажаа како термостабилни и беа способни да издржат многу циклуси на реакција. Нивната употреба овозможи да се поедностави и автоматизира PCR. Една од првите термостабилни ДНК полимерази беше изолирана од бактеријата Thermus aquaticus, која живее во топлите извори на националниот парк Јелоустоун, и беше наречена Taq полимераза.

ПЦР набргу стана главна работа на проектот за човечки геном. Општо земено, процесот не се разликува од оној што го разви Mullis, тукушто е автоматизиран. Веќе не бевме зависни од толпата дипломирани студенти кои макотрпно истураа капки течност во пластични епрувети. Во современите лаборатории кои вршат молекуларно генетско истражување, оваа работа се изведува на роботски транспортери. PCR роботите вклучени во проект за секвенционирање голем како човечкиот геном работат немилосрдно со огромни количини на полимераза стабилна на топлина. Некои научници кои работат на проектот за човечки геном беа огорчени од неразумно високите хонорари додадени на трошоците за потрошен материјал од сопственикот на патентот PCR, европскиот индустриски фармацевтски гигант Хофман-ЛаРош.

Друг „принцип на возење“ беше самиот метод на секвенционирање на ДНК. Хемиската основа на овој метод веќе не беше нова во тоа време: Меѓудржавниот проект за човечки геном (HGP) го усвои истиот генијален метод што Фред Сангер го разви во средината на 1970-тите. Иновацијата лежи во обемот и степенот на автоматизација што можеше да ги постигне секвенционирањето.

Автоматското секвенционирање првично беше развиено во лабораторијата на Ли Худ во Калифорнискиот институт за технологија. Посетувал средно училиште во Монтана и играл колеџ фудбал како бек; Благодарение на Худ, тимот го освои државното првенство повеќе од еднаш. Неговите вештини за тимска работа, исто така, добро му дојдоа во неговата научна кариера. Лабораторијата на Худ била составена од шарен екипаж од хемичари, биолози и инженери, а неговата лабораторија набрзо станала лидер во технолошките иновации.

Всушност, методот на автоматско секвенционирање беше измислен од Лојд Смит и Мајк Хункапилер. Мајк Хункапилер, кој тогаш работеше во лабораторијата на Худ, му пристапи на Лојд Смит со предлог за подобрен метод на секвенционирање во кој секој тип на база ќе биде различно обоен. Таквата идеја би можела четирикратно да ја зголеми ефикасноста на процесот Сангер. Во Сангер, при секвенционирање во секоја од четирите цевки (според бројот на бази), со учество на ДНК полимераза, се формира уникатен сет на олигонуклеотиди со различни должини, вклучувајќи и прајмерна секвенца. Потоа, формамид беше додаден во цевките за сепарација на синџирот и беше изведена електрофореза на полиакриламид гел на четири ленти. Во верзијата на Smith и Hunkapiller, дидеоксинуклеотидите се означени со четири различни бои и PCR се изведува во една цевка. Потоа, за време на електрофорезата на полиакриламид гел, ласерски зрак на одредена локација на гелот ја возбудува активноста на боите, а детекторот одредува кој нуклеотид моментално мигрира низ гелот. На почетокот, Смит беше песимист - тој се плашеше дека користењето ултра ниски дози на боја ќе доведе до тоа нуклеотидните региони да не се разликуваат. Меѓутоа, имајќи одлично разбирање за ласерската технологија, тој набрзо најде излез од ситуацијата користејќи специјални флуорохромни бои кои флуоресираат кога се изложени на ласерско зрачење.

(Целосна верзија со кликнување - 4,08 MB) Фино печатење: ДНК секвенца со помош на автоматски секвенционер, добиена од машина за автоматско секвенционирање. Секоја боја одговара на една од четирите основи

Во класичната верзија на методот Сангер, една од нишките на анализираната ДНК делува како шаблон за синтеза на комплементарна нишка со помош на ензимот ДНК полимераза, а потоа секвенцата на фрагменти на ДНК се сортира во гел по големина. Секој фрагмент, кој е вклучен во ДНК за време на синтезата и овозможува последователна визуелизација на производите на реакцијата, е означен со флуоресцентна боја што одговара на терминалната база (ова беше дискутирано на стр. 124); затоа, флуоресценцијата на овој фрагмент ќе биде идентификатор за дадена база. Тогаш останува само да се изврши детекција и да се визуелизираат производите на реакцијата. Резултатите се анализираат со компјутер и се претставени како низа од повеќе обоени врвови што одговараат на четири нуклеотиди. Информациите потоа се пренесуваат директно во информацискиот систем на компјутерот, со што се елиминира долготрајниот и понекогаш болен процес на внесување податоци што го отежнуваше секвенционирањето.

» Повеќе детали за книгата можете да најдете на веб-страница на издавачот
» Содржина
» Извадок

За Khabrozhiteley 25% попуст со користење на купон - PCR

Извор: www.habr.com